【摘要】 目的：探讨眼镜蛇毒细胞毒素(Cytotoxin，CTX)对S180 荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。方法：采用昆明小鼠S180实体瘤模型，通过腹腔注射CTX，观察CTX 对S180小鼠的肿瘤重量、亚显微结构、凋亡率和pro-caspase-3表达量的变化。结果：CTX 对S180肿瘤细胞的生长表现出明显抑制作用。0.2、0.4、0.8 mg/kg CTX剂量组的抑瘤率分别为23.8%、54.1%、63.2%；透射电子显微镜和流式细胞仪检测显示S180肿瘤细胞发生凋亡；免疫印迹结果显示pro-caspase-3蛋白表达降低，提示caspase-3被激活。结论：CTX 通过诱导细胞凋亡来抑制S180肿瘤细胞的生长。
【关键词】 眼镜蛇毒； 细胞毒素； S180； 凋亡； caspase-3
眼镜蛇毒细胞毒素(Cytotoxin，CTX)又称为心脏毒素(Cobra Cardiotoxin)，是眼镜蛇毒的主要毒性组分之一，其主要成分为蛋白质和多肽。CTX的氨基酸残基总数为60~63个，含4对二硫键，分子量为6000~7000 Da，是一类含有大量疏水氨基酸残基的强碱性多肽[1-2]。国内外研究证实，CTX不仅对体外培养的各种肿瘤细胞株有杀伤作用[3-4]，而且也能抑制体内肿瘤细胞的生长[4-5]，但其作用机制尚未清楚。本论文通过免疫印迹检测凋亡相关蛋白caspase-3的表达，从而探讨CTX抑制S180荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长是否与caspase途径有关，为今后的临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 动物 1月龄昆明小鼠购自广东省实验动物中心(许可证号SCXK粤 2008-0002)，雄雌各半，体重(20±2)g。
1.2 细胞株 S180 瘤株由中山大学医学院细胞中心提供。
1.3 药物 由广州医学院蛇毒研究所提供。
1.4 试剂与仪器 环磷酰胺(Sigma，USA)；caspase-3抗体(cell singal公司)；鼠抗人Actin抗体(newmarker公司)；PVDF膜(威佳公司)；Annexin-V/PI双染试剂盒(凯基公司)；透射电镜(CM10 Philips， Mahwah， NJ)；流式细胞仪：Coulter， USA；蛋白转移电泳槽(PowerPac Basic， Bio-Rad， USA)。
1.5 模型的制备 S180 肿瘤细胞在小鼠腹腔内稳定传2代后，无菌条件下抽取生长良好的乳白色腹水，用生理盐水稀释至1×107个/ml，以0.2 ml/只接种于小鼠前肢右侧腋下皮下。
1.6 分组和给药方法 小鼠适应性饲养7 d后进行接种。肿瘤接种后小鼠称重，并按体重大小随机分为五组，每组10只，分别为荷瘤对照组、环磷酰胺组、CTX低剂量组、CTX中剂量组和CTX高剂量组。接种S180细胞24 h后，荷瘤对照组腹腔注射0.1 ml生理盐水；环磷酰胺组腹腔注射30 mg/kg环磷酰胺0.1 ml；CTX低、中、高剂量组分别以0.2、0.4、0.8 mg/kg 腹腔给药。1 次/d，0.1 ml/次，连续给药12 d。于停药次日，颈椎脱臼处死小鼠。剥离小鼠腋下皮下瘤体，称肿瘤重量。按下列公式计算抑瘤率(%)=[A-B/A]×100%，A代表对照组瘤重，B代表处理组瘤重。
1.6 透镜电镜观察CTX对S180 荷瘤小鼠的亚显微结构的影响 取荷瘤对照组和CTX中剂量组的S180肿瘤组织，用2.5%戊二醛预固定，1% 锇酸后固定，环氧树酯包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双染色，透射电镜观察各组肿瘤细胞的形态。
1.7 Annexin-V/PI双染检测凋亡率 用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织，然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织，边搓边滴入PBS缓冲液。然后用PBS洗涤细胞两次，加入500 μl的Binding Buffer悬浮调整细胞浓度为1×106/ ml。最后分别加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光、室温反应15 min后，用流式细胞仪检测凋亡率。
1.8 免疫印迹法检测 用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织，然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织，边搓边滴入PBS缓冲液。用PBS洗涤细胞两次，提取蛋白：每106个细胞依次加入300 μl RIPA蛋白裂解液及3 μl PMSF (phenylmethysulfonyl fluoride) 溶液，用200 μl枪头吸打混匀，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 ×g 离心30 min。将上清移至新管，BCA法测定蛋白含量。
SDS-PAGE 凝胶电泳：配制12 %的分离胶与5%浓缩胶，灌胶，待胶聚合完全，将准备好的样品液和预染Marker 分别上样，使用BioRad 电泳装置，80V 恒压电泳15 min，120 V 恒压电泳70 min。转膜300 mA 1 h，转移完成后取出膜，切角做标记。加5%的脱脂奶粉封闭孵育膜，室温摇床振荡l h。加一抗(稀释度1∶1000 )，室温摇床孵育2 h。PBST洗膜，15 min×3 次，加HRP 标记的二抗(稀释度1:8000 )，室温摇床孵育l h，PBST 洗膜，15 min×3 次，进行化学发光检测。
1.9 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件分析，实验数据用(x±s)表示，进行方差分析、q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 CTX 对肿瘤重量的抑制作用随剂量增加而增加，CTX低、中、高剂量组的肿瘤重量都明显低于荷瘤对照组(P<0.05)。CTX低、中、高剂量组肿瘤重量的抑瘤率分别为23.8%、54.1%、63.2%。见图1。
注：A为荷瘤对照组和处理组的肿瘤重量；B为肿瘤重量的抑制率。与荷瘤对照组比较，*P< 0.05，**P<0.01