施肥方式对黄瓜连作土壤微生物区系及多样性的动态影响
摘要：利用稀释平板计数和PCR-变性梯度凝胶电泳（简称PCR-DGGE）等方法，分析化肥（FT）、普通有机肥+化肥（FC）、微生物有机肥+化肥（FB）、不施肥（CK）等不同基肥处理条件下，连作1、3、5、7茬黄瓜土壤细菌、放线菌、真菌数量及多样性的动态变化。结果表明：（1）随着连作茬数的增加，根际土壤微生物数量呈逐渐增加趋势；（2）与对照相比，施用化肥处理总体上明显促进了连作土壤中放线菌、真菌数量的增加，而对细菌数量的增加有明显的抑制作用，施用普通有机肥+化肥对细菌、放线菌数量的增加均有不同程度的促进作用；（3）连作及不同施肥方式对土壤细菌群落结构均能产生不同程度的影响，除对照处理外，其他施肥处理土壤细菌多样性及丰富度随着连作茬数的增加呈下降趋势，相对于化肥及普通有机肥+化肥处理，微生物有机肥+化肥处理对维持连作过程细菌多样性及丰富度具有明显作用；（4）连作均促进了FT、FB、FC等3种施肥处理根际土壤真菌多样性及丰富度的上升，但与对照相比上升幅度较小，在连作7茬后土壤真菌多样性及丰富度表现为FB>FC>FT。
关键词：施肥方式；黄瓜连作；细菌；真菌；多样性；PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）
中图分类号： S154.3文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0231-05
隨着我国现代农业的不断发展，设施栽培面积逐年增加并呈规模化趋势。在市场经济驱动下的商品化设施蔬菜生产中，连作障碍普遍发生。黄瓜作为设施蔬菜的主要品种之一，近年来其连作障碍的发生机制及防治受到学者们的广泛关注。已有研究表明，自毒作用、土壤理化性质劣化、土壤微生物区系失衡是黄瓜连作障碍发生的主要原因[1-2]，并且认为土壤灭菌[3]、嫁接[4]、合理轮作[5]、施用有机肥及微生物肥料[6-7]等措施可有效防止黄瓜连作障碍的发生。其中施用有机肥在平衡矿质营养、提高作物品质和产量的同时，可提高土壤微生物活性，有利于土壤健康微生物区系的形成[8-10]。作为一种方便、低成本的农艺措施，合理施用有机肥对黄瓜连作障碍的预防与控制具有重要的实践意义。目前有关施肥方式对黄瓜连作土壤微生物区系影响的研究较少，关于不同施肥方式对黄瓜连作过程土壤微生物区系及多样性动态变化的研究更是鲜有报道[10-12]。本研究基于无机肥（化肥）、有机肥、微生物有机肥，设置不同的施肥处理，跟踪分析不同施肥条件下大棚黄瓜连作过程中土壤微生物区系及多样性的动态变化，以期为黄瓜连作土壤微生物区系的维持及连作障碍的预防及缓解提供理论基础。
1材料与方法
1.1试验设计
试验于2011年7月至2015年5月在江苏省扬州市农作物品种区域试验站大棚内进行。试验所用土壤为沙质壤土，已经连续4年种植黄瓜，每年种植2茬，共连作7茬。试验共设4个处理，每个处理3次重复，每个处理小区面积为27 m2，小区间隔 25 cm，并采用南北向条垄方式种植，每季收获后将垄拉平、施肥后再起垄，并逐茬沿用。在盛果期每个小区追施1次2.024 kg的复合肥，具体处理和代号见表1。
1.2试验材料
化肥（复合肥，即无机肥）为市售，其中N ∶[KG-*3]P2O5 ∶[KG-*3]K2O 为15 ∶[KG-*3]13 ∶[KG-*3]12；普通有机肥为发酵鸡粪；微生物有机肥由南京农业大学提供。供试土壤基本理化性质：总氮含量1.81 g/kg，总磷含量 0.87 g/kg，速效磷含量43.66 m g/kg，速效钾含量 155.81 mg/kg，有机质含量26.96 g/kg，总盐含量5.67 g/kg，电导率为806.50 μS/cm，pH值为7.80。
1.3土壤样品采集与处理
于每茬黄瓜成熟期对不同处理及各重复小区采用5点法采集黄瓜根际土壤样品，采用4分法混匀后置于4、 -80 ℃ 冰箱中保存。
1.4土样微生物数量测定
采用稀释平板法[13]。分别用牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏孟加拉红培养基、高氏1号培养基对土壤细菌、霉菌、放线菌数量进行测定。微生物数量以1 g干土中的菌落数表示。
1.5土壤总DNA的提取
采用试剂盒（FastDNA SPIN Kit，MP Biomedicals，美国）提取各土壤样品微生物总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，-20 ℃保存。
1.6土样DNA的PCR扩增
分别采用细菌16S通用引物P2/P3+GC[14]和真菌28S通用引物U1/U2+GC[15]对土壤微生物总DNA进行PCR扩增，引物具体信息如表2所示。细菌PCR扩增反应程序为 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。真菌PCR扩增反应程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。
细菌、真菌PCR扩增体系为Taq DNA聚合酶（大连TaKaRa公司）0.25 U，10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/反应，大连TaKaRa公司）4 μL，引物各1 μL（20 μmol/L），牛血清白蛋白（BSA） 5 μL（10 mg/mL），模板DNA 2 μL，无菌水补足至50 μL。
扩增产物均经1.5%琼脂糖凝胶电泳检验后，于4 ℃冰箱中保存。
1.7PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）
采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突变检测系统对PCR产物进行电泳分离。细菌及真菌电泳条件均为8%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为20%～60%，电泳缓冲液为1×TAE，130 V 电压，60 ℃电泳720 min。电泳结束后用EB染色 30 min，无菌水褪染10 min，最后用Bio-Rad凝胶成像分析系统观察结果并拍照。