【摘要】 目的 比较免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子和免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的白喉毒素A链基因对淋巴瘤细胞生长抑制。方法 将白喉毒素A链基因或细菌β半乳糖苷酶基因与免疫球蛋白启动子/增强子相连构建成白喉毒素A链真核表达载体pcDNA3IgκDTA、pcDNA3IgHDTA或细菌β半乳糖苷酶真核表达载体pcDNA3IgκLacZ、pcDNA3IgHLacZ。由脂质体介导将质粒转染至产或不产免疫球蛋白的真核细胞中，检测β半乳糖苷酶基因在不同细胞中的表达水平，并进一步检测白喉毒素A链基因的表达对转染细胞的生长抑制作用。结果 由免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子或免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的β半乳糖苷酶基因只能在产免疫球蛋白(κ轻链型)细胞株CA46中表达。当β半乳糖苷酶基因与质粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA共转染时，β半乳糖苷酶基因的表达只在CA46细胞中被抑制。质粒pcDNA3IgκDTA、pcDNA3IgHDTA的表达均能明显抑制CA46细胞的生长，而对照质粒pcDNA3IgκLacZ或pcDNA3IgHLacZ对CA46细胞则无明显作用，并且pcDNA3IgκDTA的抑制作用较pcDNA3IgHDTA更强。结论 由免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子或免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的白喉毒素A链基因的表达能特异性地杀伤产免疫球蛋白(κ轻链)的肿瘤细胞。并且免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子较免疫球蛋白重链启动子/增强子有更强的启动转录活性。
【关键词】 基因治疗;白喉毒素;免疫球蛋白
作者单位：350000 福州，福建医科大学附属第三医院肿瘤科(姚娜)；福建医科大学附属第一医院血液科(芮红兵)
通讯作者:姚娜 白喉毒素A链(DTA)基因在真核细胞中的表达可以产生细胞毒性作用并杀死该细胞［1,2］。白喉毒素对于真核细胞来说，其毒性是极其强烈的，但将DTA基因与组织细胞特异性顺式调控序列(启动子/增强子)连接，则该基因的表达只限定在该种特定细胞中，在其他细胞中将不表达。已有实验证明，在转基因老鼠中导入由组织细胞特异性启动子控制的DTA基因只能在特定细胞中表达，而对其他细胞无毒性作用，因此，白喉毒素基因组织特异性表达的特性可以应用于恶性肿瘤的靶向治疗［3,4］。免疫球蛋白启动子/增强子可以有效而特异性地控制其下游基因在产免疫球蛋白的B淋巴细胞或骨髓瘤细胞中表达［5］。如将免疫球蛋白启动子/增强子与某些毒素基因相连，可以使该基因特异性地在产免疫球蛋白的细胞中表达，从而可将此毒素应用于某些B淋巴系恶性肿瘤的治疗。本研究探讨了不同免疫球蛋白启动子控制的白喉毒素A链基因对淋巴瘤细胞的抑制作用。
1 材料与方法
11 质粒与试剂 由鼠免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子控制的白喉毒素A链真核表达载体pcDNA3IgκDTA、由鼠免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的白喉毒素A链真核表达载体pcDNA3IgHDTA由本室构建，同时构建的还有含报告基因β半乳糖苷酶基因的真核表达载体pcDNA3IgκLacZ、pcDNA3IgHLacZ。巨细胞病毒(CMV)启动子控制的真核表达载体pcDNA3LacZ由苏津自博士(福建省高血压研究所)惠赠。SP2/0Ag14细胞(SP2)为鼠骨髓瘤细胞株，不产生也不分泌免疫球蛋白；CA46为人Burkitts 淋巴瘤细胞株，产生及分泌IgM免疫球蛋白及表面IgMκ轻链，K562为人白血病细胞株，该三种细胞株均购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。培养条件：含10%灭活小牛血清的HDMEM培养液，37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养。Wizard DNA Cleanup System DNA纯化试剂盒、细胞活力检测试剂盒CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay及脂质体转染试剂盒TransfastTM Transfection Reagent购自Promega公司；培养基HDMEM购自GIBCO公司。
1．2 方法
121 质粒DNA的转染及β半乳糖苷酶活性测定 质粒DNA的转染由脂质体(TransfastTMtransfection reagents, Promega)介导，同时转染三种细胞。转染方法按说明书进行：在05 ml无血清的HDMEM培养液中加入4 μg质粒DNA、12 μl脂质体，立即涡旋混匀以形成脂质体/DNA混合体，再将脂质体/DNA混合体加入培养于6孔培养板的1×106细胞中， 置37℃、5%CO2培养箱中转染1 h，再加入含10%小牛血清的完全培养基5 ml，置37℃、5%CO2中培养48 h后收集细胞，将细胞反复冻融三次获得细胞提取液，然后按《分子克隆实验指南》中的方法进行β半乳糖苷酶活性的检测［6］。为了消除脂质体在不同细胞中转染率差异的影响，同时以质粒pcDNA3LacZ转染相同的细胞，以pcDNA3LacZ转染细胞的β半乳糖苷酶活性为标准，目的基因转染细胞的β半乳糖苷酶相对活性为pcDNA3IgκLacZ /pcDNA3LacZ和pcDNA3IgHLacZ /pcDNA3LacZ。
122 不同免疫球蛋白启动子控制的白喉毒素A链基因对β半乳糖苷酶活性的抑制 将质粒 pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA与β半乳糖苷酶基因进行共转染实验，转染细胞为CA46细胞株，转染方法仍由脂质体(TransfastTMtransfection reagents, Promega)介导，转染方法按说明书进行。质粒DNA包含2 μg质粒pcDNA3LacZ及2 μg质粒 pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA，对照组以质粒pcDNA3代替pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA。以共转染CA46细胞后48 h瞬时表达的β半乳糖苷酶活性的抑制程度来估测质粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA在CA46细胞中DTA的表达水平。