阮圣玥，刘 滔，莫秋芬，冯凤琴*
（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）
机体胃肠道中定植着数量众多、功能复杂的微生物群落，统称为肠道菌群[1]。肠道菌群可直接或间接通过肝肠轴、脑肠轴、肠睾轴等方式参与机体新陈代谢和免疫调节等诸多生理活动[2-4]，并且肠道菌群与代谢综合征、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等许多人类疾病高度相关[3,5-8]。
近年来，国际顶级学术期刊发表的一系列研究成果表明，一些广泛使用的食品添加剂，如乳化剂和合成甜味剂通过影响肠道菌群增加了患肥胖、糖尿病和炎症性肠病等慢性疾病的风险[5,9-10]。2014—2020年，多项研究报道合成甜味剂（糖精、三氯蔗糖和阿斯巴甜）可改变肠道菌群组成及代谢通路，导致啮齿动物肥胖、糖耐量受损和肝炎[11-12]；
膳食添加阿斯巴甜引起高脂高糖饮食母代小鼠肠道菌群的变化会传导到子代鼠，并导致子代肥胖和糖耐量受损[13]。2015—2019年，一系列研究发现食品乳化剂羧甲基纤维素和聚山梨酯80会影响肠道菌群组成和代谢功能，引起小鼠肠道炎症并导致代谢综合征、非酒精性脂肪肝和癌症的发生[14-16]。2019—2022年，系列研究发现在不同膳食条件下，食品乳化剂月桂酸单甘油酯（glycerol monolaurate，GML）对实验动物产生显著的健康促进或危害作用，且肠道菌群的变化与之密切相关[17-20]。研究发现，饲料中添加1 600 mg/kg GML能够促进小鼠肠道中Oscillibacter等有益的抗炎细菌生长，改善葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的小鼠结肠炎[18]；
而饲料中添加150 mg/kg GML可诱导小鼠肠道菌群失调，引起系统轻度炎症[17]。
食品防腐剂是能防止食品由微生物引起的腐败变质，从而延长食品贮存期的食品添加剂[21]。作为有目的地直接添加入食品的痕量化学物质，食品防腐剂在食品工业上应用广泛，具有强且广谱的抑菌性[22-23]，摄入后很可能对宿主肠道菌群产生一定的影响，进而产生正面或负面的健康效应。例如，对羟基苯甲酸酯可增加血清瘦素水平、促进脂肪堆积、干扰内分泌系统从而引起肥胖[24]；
乳酸链球菌素能够短暂维持小鼠肠道菌群组成稳定，抑制部分条件致病菌的生长[25]；
丙酸盐可影响肠道微生物代谢过程，导致小鼠和人体胰岛素抵抗和高血糖症[26]。但是，目前关于食品防腐剂对肠道菌群和宿主健康的影响还缺乏系统的研究和总结。基于此，本文综述了食品防腐剂对肠道菌群和宿主健康影响的研究现状，希望能够引起广大科研工作者和读者对食品防腐剂通过肠道菌群对宿主健康可能造成的影响的关注和重视，并为目前已有的食品防腐剂的安全评价体系提供新视角和思路。
1.1 肠道菌群与机体健康
肠道菌群通过参与机体的新陈代谢、免疫系统的发育和调节，帮助宿主完成多种生理生化功能[27]。肠道菌群紊乱与肥胖[28-29]、糖尿病[30]、心血管疾病[31]、炎症性肠病[32-33]等许多慢性疾病高度相关。目前报道的与肠道菌群相关的疾病及其可能作用机制见表1。
表1 与肠道菌群相关的疾病及其可能作用机制Table 1 Diseases related to gut microbiota and possible underlying mechanisms
1.2 肠道菌群与食品防腐剂的研究进展
食品防腐剂是能防止由微生物所引起的食品腐败变质，以延长食品储存期的食品添加剂[21]。食品防腐剂是食品工业上最广泛应用的一类食品添加剂，是能直接加入食品的化学物质。大量研究表明，食品防腐剂具有优良的抑菌功能，对多种细菌、真菌、酵母菌、霉菌等微生物具有较好的抑制或杀灭作用[23,49-51]。经食品摄入的防腐剂可被肠道吸收，部分通过尿液和粪便排出，因此极有可能会影响肠道菌群，并对宿主生长代谢及免疫等方面产生健康影响。2019年，Peng Qiannan等通过实验发现山梨酸钾可通过改变肠道菌群组成和功能，抑制肠道菌群的代谢从而激活斑马鱼的免疫调节功能[52]。Song Bo等研究发现丙酸盐能够通过调节小鼠肠道菌群来缓解高脂饮食诱导的脂质代谢异常[53]。Liu Dan等在肉鸡每千克日粮中添加40 mg溶菌酶，结果表明溶菌酶可以减少肉鸡产气荚膜梭菌定植，减轻肠黏膜损伤和肠道细菌移位，降低回肠中大肠杆菌和乳酸杆菌的水平，增加肠道溶菌酶活性，从而改善鸡的肠道屏障功能和生长性能[54]。Xiao Dingfu[55]和Guan Guiping[56]等相继发现在膳食中补充壳聚糖能够降低小鼠肠道菌群中厚壁菌门（Firmicutes）/拟杆菌门（Bacteroidetes）（F/B）的比例，并且通过更快地恢复柠檬酸杆菌感染引起的肠道菌群的变化，降低肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和IL-6的水平，更好地控制肠道炎症。
综上所述，食品防腐剂对宿主健康及肠道菌群具有多方面潜在的影响，已有大量报道证明这些影响真实存在。鉴于此，后文详细阐述并归纳食品防腐剂对肠道菌群和机体健康的影响。
2.1 食品防腐剂影响肠道菌群多样性
人体肠道中微生物数量沿胃肠道增加[57]，总数超过1014[58]。厚壁菌门和拟杆菌门是肠道菌的两个主要菌门，占肠道菌总数的90%[59]。F/B比值是反映肠道菌群组成的重要指标之一，其会随着抗生素干预、膳食营养素和病理条件等方面的改变而发生显著变化[29,60]。尽管肠道菌群中存在主要的优势菌门，但每个个体中有数千种不同的肠道菌，其种类和相对丰度因人而异。α多样性与β多样性可用于共同评价肠道微生物的总体多样性。
α多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，是反映微生物均匀度（Shannon、Simpson指数）和丰富度（Chao、Ace指数）的综合指标。食品防腐剂对α多样性的影响也会使用Faith丰富度指数和Pielou均匀度指数进行评价。Hrncirova等将人肠道菌群移植在小鼠体内，发现食品防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾和亚硝酸钠的混合物降低了小鼠肠道菌群α多样性和Faith丰富度指数[61]。但是，多项研究表明丙酸钠、乳酸链球菌素（Nisin）、溶菌酶等食品防腐剂可以恢复由于肥胖、腹泻及结肠炎等引起的肠道菌群α多样性的降低[53,62-64]，同时显著增加F/B比值[64]。此外，Guan Guiping等研究发现膳食添加壳聚糖后，小鼠粪便和结肠样本中的菌群丰富度相似，但结肠菌群比粪便菌群表现出更高的多样性[56]。Xiao Dingfu等的研究[55]也获得了相似的结果。
β多样性分析通过对不同微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析，基于不同的距离算法探索样本间群落组成的相似性或差异性。在β多样性方面，多项研究发现小鼠肠道微生物对防腐剂处理高度敏感，对照组和添加剂处理组的肠道菌群具有显著差异[61,63]，并且小鼠厚壁菌门相对丰度降低、拟杆菌门丰度增加[61]。此外，Song Bo等发现膳食添加丙酸钠的HFD小鼠肠道菌群结构介于普通膳食组和HFD组之间，进一步研究发现丙酸钠处理可将HFD组小鼠厚壁菌门和乳杆菌门的相对丰度恢复至普通膳食组水平[53]。
2.2 食品防腐剂影响肠道共生有益菌群
人体内有数以亿计的微生物定植，拟杆菌、梭菌、双歧杆菌、乳酸杆菌是人体肠道中主要的共生菌群，双歧杆菌和乳酸杆菌也被称为益生菌。共生有益菌群能与人体形成良好的共生关系，辅助消化多种食物，维持肠道健康[65]。
现有的大量研究发现，食品防腐剂能够显著提高肠道共生有益菌群中双歧杆菌和乳酸杆菌的含量[66-71]。田洪源等通过小鼠灌胃实验，发现蛋清溶菌酶和重组溶菌酶均能促进小鼠肠道双歧杆菌和乳酸杆菌生长[70]。王丽娜等研究发现30 mmol/L山梨酸能够将断奶仔猪空肠和回肠中双歧杆菌数量显著提高1.4～2.0 倍[67]。Li Haifeng等的研究结果显示，日粮中添加0.05%丙酸盐能显著富集肉鸡盲肠中乳酸双歧杆菌[68]。Bernbom等发现给大鼠接种产乳链菌肽的乳酸乳球菌后，大鼠粪便中的双歧杆菌丰度有一定程度的增加[69]。此外，Gerasimidis等将13 名健康志愿者的粪便样本与多种食品添加剂一同培养发酵，发现食品防腐剂苯甲酸钠可在体外显著提高双歧杆菌的丰度[66]。
2.3 食品防腐剂影响肠道条件致病菌群
相对于共生有益菌群而言，肠道内还有一类细菌，它们属于肠道中的不稳定因素，肠道健康时，菌群与宿主、菌群与菌群之间维持着良好的生存平衡；
但当共生菌群遭到破坏时，这种平衡关系被打破，原来不致病的细菌成为致病菌进而引发多种肠道疾病，这种细菌被称为条件致病菌，主要包括肠球菌、肠杆菌等。
现有的证据表明，一些食品防腐剂能够较好地抑制肠球菌和肠杆菌的生长[62,66,69-70,72-76]。Zhang Di等研究发现饲料中添加1 g/kg及0.25 g/kg壳聚糖均显著抑制了小鼠肠杆菌和肠球菌生长[74]。田洪源等的研究结果同样表明，蛋清溶菌酶和重组溶菌酶两种溶菌酶均能不同程度地降低小鼠肠道粪肠球菌数量，相比之下，重组溶菌酶对大肠埃希氏菌（Escherichia coli）抑制作用更加明显[70]。值得关注的是，丹麦一研究团队对移植了一名健康女性粪便样本菌群的大鼠分别饲喂Nisin和产Nisin的乳酸乳球菌，结果发现Nisin饲喂组大鼠肠道中肠球菌/链球菌的比值较高，而饲喂添加了产Nisin的乳酸乳球菌的大鼠肠道样本中二者的比值则较低，说明部分Nisin在胃肠道中被降解或失活而失去抑制作用[69]。除此之外，还有众多的研究发现食品防腐剂苯甲酸、山梨酸以及溶菌酶均能够显著抑制猪肠道内的大肠杆菌以及肠球菌的生长[72-73,75-76]。
除肠杆菌和肠球菌，也有一些研究表明食品防腐剂能够在不同程度上影响拟杆菌和梭菌的变化[62,77-78]。拟杆菌参与碳水化合物的发酵、含氮物质的利用以及胆汁酸和其他类固醇的生物转化，但当机体免疫系统受损、肠道屏障遭到破坏（如肠漏）时，拟杆菌进入到胃肠道以外的身体部位，则可引起或加剧脓肿等感染[79]。梭菌具有一定的抗炎、抑制致病菌的作用，少部分梭菌产外毒素，对人或动物致病[80]。Jia Zhifeng等对大肠杆菌O1诱导的腹泻模型小鼠灌胃0.1 mg/mL乳酸链球菌肽72 h后，发现小鼠盲肠中拟杆菌属和乳酸杆菌数量较对照组显著增加，而双歧杆菌数量则有所下降，但差异不显著[62]。Abdel-Latif等研究发现在肉鸡膳食中添加溶菌酶能够降低粪便样本中的梭菌含量[78]。Deng Bo等分别向断奶仔猪和母猪日粮中添加溶菌酶后发现，在第28天时断奶仔猪粪便中的优势菌群为狭义梭菌和拟杆菌，而母猪粪便中的长双歧杆菌相对丰度显著增加，双歧杆菌和卵形拟杆菌的相对丰度趋于增加[77]。
3.1 食品防腐剂通过肠道菌群影响机体生长代谢
许多动物实验表明，食品防腐剂能够通过肠道菌群影响机体脂代谢，缓解高脂膳食引发的肥胖，对机体生长代谢产生影响。Tang Di等给HFD小鼠补充壳聚糖后发现，壳聚糖通过增加梭菌丰度、减少链状芽孢杆菌丰度，从而缓解高脂饮食小鼠的肥胖和肠道炎症[81]。类似地，Xiao Dingfu等发现膳食壳聚糖能够通过增加空肠和回肠的菌群多样性以及调节肠道菌群，主要是通过降低F/B的比例来降低小鼠体质量[55]。在一项动物实验中发现，小鼠口服丙酸钠可显著改善高脂饮食引起的肠道菌群失调，通过恢复肠道菌群的丰富性和多样性以及厚壁菌门与拟杆菌门的比例缓解脂质代谢障碍[53]。Li Haifeng等也发现丙酸盐通过抑制肉鸡的采食量，降低盲肠F/B比值、显著降低变形菌门的丰度来抑制肉鸡的脂肪沉积[68]。另外一项研究表明，Nisin可提高盲肠菌群多样性，有利于增加腹泻小鼠盲肠中厚壁菌门的数量，降低拟杆菌门的数量，同时降低血清、回肠和脑组织中金属肽酶含血小板反应蛋白（recombinant A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 1，ADAMTS1）的含量和回肠中胰岛素的含量，增加血清、空肠和脑组织中总胆固醇的含量，从而影响腹泻小鼠盲肠菌群结构及脂代谢[64]。
3.2 食品防腐剂通过肠道菌群影响机体免疫
免疫功能是人体的一项重要生理功能，反映了机体对疾病的抵抗能力。对肠道菌群的广泛研究表明，食品防腐剂在一定程度上能够通过影响肠道菌群改善机体肠道屏障功能和腹泻，调节机体免疫[56,77,82-83]。
目前大量的动物实验表明，天然食品防腐剂溶菌酶可有效改善肠道菌群结构，增强肠道屏障功能[54,63,76-77,82]。在一项以结肠炎小鼠为模型的实验中，研究人员给小鼠口服驴奶来源溶菌酶（donkey milk lysozyme，DML），结果发现DML增加了肠道菌群组成的多样性，促进了益生菌的生长并抑制了有害细菌的生长，同时它能够通过增加紧密连接相关蛋白Occludin和ZO-1的表达并降低与上皮渗漏高度相关的Claudin-2蛋白的表达，提高结肠炎小鼠的肠道细胞紧密度并降低肠道通透性，改善肠道屏障功能，缓解结肠炎小鼠的腹泻症状和结肠损伤[63]。Huang Guangping等也发现，感染产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）的仔猪食用含重组人来源溶菌酶（human lysozyme，hLZ）的牛奶后，腹泻程度和持续时间较对照组相比分别明显降低和缩短，hLZ的保护作用与乳酸杆菌等肠道有益菌的显著富集有关，并且hLZ可通过增加Occludin和ZO-1的表达防止ETEC诱导的肠黏膜损伤[82]。另外还有一项研究表明，向仔猪基础日粮添加0.15%溶菌酶降低了仔猪结肠F/B比值，并增加了变形杆菌丰度，说明溶菌酶能够通过调节肠道菌群增强免疫功能并降低仔猪腹泻率[77]。
除了通过影响肠道菌群改善机体肠道屏障功能以外，一系列研究证实了食品防腐剂在调节机体免疫分子方面也发挥关键作用。2016年，Guan Guiping等向感染柠檬酸杆菌的小鼠膳食中补充壳聚糖（chitosan，COS）后发现，COS会改变小鼠肠道菌群的组成，从而抑制核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化并减少TNF-α和IL-6的产生，继而缓解小鼠肠道炎症[56]。Peng Qiannan等研究发现，斑马鱼暴露于0.1 g/L和1 g/L的山梨酸钾水溶液2 周后肠道中白细胞介素（interleukin，IL）-1β和TNF-α的含量显著降低，山梨酸钾可通过改变肠道菌群组成和代谢途径激活斑马鱼的免疫调节功能[83]。韩国科学家也发现向断奶仔猪日粮中添加0.5%的苯甲酸可以显著增加肠道有益菌枯草芽孢杆菌丰度，从而显著下调断奶仔猪胃肠道中促炎细胞因子IL-6 mRNA的表达量[84]。IL-10含量升高暗示机体内可能有炎症，存在免疫抑制；
IL-18又称干扰素-γ诱导因子，能够诱导严重的炎症反应和各种疾病[85]，IL-10和IL-18含量的升高表明溶菌酶可能引起动物肠道的轻度炎症。有研究报道，每吨基础日粮添加90 g溶菌酶显著降低了肉鸡粪便中有害的大肠菌群和梭状芽孢杆菌数量，有益的乳酸杆菌数量显著增加，同时显著上调了肉鸡回肠IL-10和IL-18mRNA的表达量，通过正向调节肠道菌群和与肠道非特异性免疫有关基因的表达促进了肉鸡的肠道健康[78]。
有关食品防腐剂对肠道菌群和宿主健康的影响见图1。
图1 食品防腐剂对肠道菌群和宿主健康的影响示意图[53,55-56,61-64,66-78,81-85,87]Fig.1 Schematic diagram showing the effects of food preservatives on gut microbiota and host health[53,55-56,61-64,66-78,81-85,87]
近年来，随着肠道菌群检测技术的提高及检测成本的急剧下降，发现越来越多的研究关注食品防腐剂可能给肠道菌群及机体健康带来的影响[86]，生物来源的天然食品防腐剂（如Nisin、溶菌酶、壳聚糖等）通过抑制肠道条件致病菌并增加乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌的生长，调节肠道菌群，从而改善脂代谢、机体肠道屏障功能和腹泻，增强机体免疫，带来积极正面的影响；
但也有研究发现即使在限定范围内使用食品防腐剂，也可能对肠道菌群造成负面的影响，例如部分食品防腐剂（如苯甲酸、山梨酸、丙酸盐等）会降低肠道菌群多样性、引起肠道轻度炎症[61,87]，可能会给机体健康造成影响。食品防腐剂是广泛使用的一般公认安全的食品添加剂，世界各国对食品添加剂的安全性评估是非常严格的，有科学严密的评价程序和体系[88]，但由于肠道菌群的复杂性和检测方法的局限性，常规的评价方法并未关注食品添加剂对肠道菌群的影响，因此，未来还需全面综合评估食品防腐剂对肠道菌群和人体健康的影响。
值得注意的是，目前的研究主要集中在单一食品防腐剂对肠道菌群的影响上，然而实际生产加工中通常将几种防腐剂结合使用。因此，需要进一步研究多种食品防腐剂复配使用对肠道菌群的综合影响，从而反映实际应用中的情况。此外，细菌多样性减少并不一定意味着健康状况不佳，因此还需结合其他指标多方位地评价食品防腐剂与菌群及宿主健康的关系。除此之外，有研究表明某些食品防腐剂可以促进炎症或加剧代谢性疾病以及肠道菌群的变化[55-56,87]。然而，菌群的变化是否是代谢和免疫功能变化的原因或结果，以及菌群变化带来功能的改变及其机制尚有待进行更深入的研究。最后，关于人类肠道菌群对食品防腐剂敏感性的实验数据很少，大部分集中于动物模型，只有非常有限的研究涉及人类肠道菌群。近年来，体外人体肠道微生物生态系统模拟器模型已被用于肠道菌群变化相关的研究[89]。未来在条件允许的情况下，可以积极应用类器官模型进行研究，同时结合开展临床试验，这将有助于阐明食品防腐剂对肠道菌群结构的影响及其相互作用对健康的影响。
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