谈 婷 ，姜友军 ，袁华山 ，拾 强 ，黄文杰 ，邓 庆 ，董珊珊 ，韩培培 ，周云维 ，肖理文
（1.上海飞测生物科技有限公司，上海 201400；
2.中储粮质检中心有限公司，北京 100043；
3.中储粮江苏质检中心有限公司，南京 211155；
4.中央储备粮上海直属库有限公司，上海 200241；
5.广西中储粮粮油质监中心，南宁 530200；
6.南京微测生物科技有限公司，南京 210031）
我国是受真菌毒素污染最严重的国家之一。
根据国家粮食和物资储备局不完全统计， 我国每年因真菌毒素污染造成的粮食损失累计达3 000 多万吨，超过陕西、甘肃、青海、宁夏及西藏5 个西部省区全年粮食产量的总和， 直接经济损失高达600~800亿元[1-3]。
真菌毒素是产毒真菌在适宜的环境条件下产生的，可通过污染谷物、饲料或经动物源性食品进入食物链[4-6]，对人类和动物健康造成致癌、致畸、致突变等伤害[7-9]。
目前市场上粮油真菌毒素的检测采用快检和大型仪器检测相结合的方式[10-13]。
快检用于大量样品的初筛及现场检测，检测样品量大，操作快速简便，仪器和耗材成本低，已被广泛使用；
大型仪器设备主要用于法检或可疑阳性样品的确证， 仪器设备以进口为主，价格昂贵，对检测环境和操作人员要求高，检测通量低，时间长[14-16]。
因此，快检作为真菌毒素检测的技术手段已被政府监管部门和企业广泛接受和采用。但是，目前快检产品大部分都是基于传统的酶联免疫法和胶体金免疫层析法， 虽然操作快速简便，但灵敏度、准确度和精密度较低，全手工操作，无法满足日趋严格的粮食质量检测标准和要求， 且均为一个卡（条）检测一个项目，还没有多合一的检测卡出现。
本文研制了一种基于时间分辨荧光纳米微球的黄曲霉毒素B1/呕吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素三合一荧光定量快速检测卡（简称ADZ 荧光定量快速检测卡）， 并通过对多种粮食谷物饲料样品检测，验证了该真菌毒素三合一荧光定量快速检测卡的技术性能， 实现了粮食中真菌毒素类多合一的快速、简便、准确、定量、自动化检测。
1.1 试剂
时间分辨荧光微球， 南京微测生物科技有限公司；
黄曲霉毒素B1 单抗、黄曲霉毒素B1 抗原、呕吐毒素单抗、呕吐毒素抗原、玉米赤霉烯酮单抗、玉米赤霉烯酮抗原，均为自制；
黄曲霉毒素B1（AFB1）标准品、呕吐毒素（DON）标准品、玉米赤霉烯酮（ZEN）标准品均来自国家粮食和物资储备局科学研究院。
1.2 耗材
硝酸纤维素膜（NC 膜），美国 Millipore 公司；
样品垫（玻璃纤维），美国奥斯龙；
吸水纸、PVC 胶板，上海金标生物科技有限公司。
1.3 仪器与设备
GL-21M 高速冷冻离心机， 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；
FD-600 型荧光定量快速检测仪，上海飞测生物科技有限公司；
DHG-9620A 电热鼓风干燥箱， 上海天呈实验仪器制造有限公司；
XYZ 3060划膜仪，美国Biodot；
HGS510 峰航划膜喷金仪，杭州峰航科技有限公司；
FD-2200 型检测卡恒温孵育器，上海飞测生物科技有限公司；
HGS201 可编程切条机，杭州峰航科技有限公司。
2.1 标记抗体荧光胶乳的制备
（1）黄曲霉毒素 B1 胶乳（简称 AFB1 胶乳）、呕吐毒素胶乳 （简称DON 胶乳）、 玉米赤霉烯酮胶乳（简称ZEN 胶乳）的制备，三种胶乳标记工艺都是采用一步直接偶联法。
取40 μL 时间分辨荧光微球1 加入到360 μL活化缓冲液中，加入 10 mg/mL EDC 12 μL，37 ℃摇床振荡 30 min。
15 000 r/min 离心 10 min，弃上清。用标记缓冲液重悬至400 μL，振荡混匀。
加入一定量的标记抗体， 振荡混匀后于 37 ℃摇床反应120min。
15 000 r/min 离心 10 min，弃上清。
用封闭缓冲液重悬至400 μL， 振荡混匀后于37 ℃摇床反应 30 min。
15 000 r/min 离心 10 min，弃上清。
用微球稀释液重悬至400 μL，振荡混匀，备用。
（2）鸡 IgY 胶乳（简称 IgY 胶乳）的制备时间分辨荧光微球1 标记鸡IgY 抗体采用的是一步直接偶联法。
取40 μL 时间分辨荧光微球1 加入到360 μL活化缓冲液中，加入 10 mg/mL EDC 12 μL，37 ℃摇床反应 30 min。
15 000 r/min 离心 10 min，弃上清。用标记缓冲液重悬至400 μL，振荡混匀。
加入一定量的鸡IgY 抗体， 振荡混匀后于37 ℃摇床反应60min。15 000 r/min 离心 10 min，弃上清。
用封闭缓冲液重悬至400 μL， 振荡混匀后于37 ℃摇床反应30min。15 000 r/min 离心 10 min，弃上清。
用微球稀释液重悬至400 μL，振荡混匀，备用。
（3）黄曲霉毒素B1/呕吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素胶乳（简称ADZ 胶乳）的制备，根据AFB1 胶乳、DON 胶乳、ZEN 胶乳、IgY 胶乳各自的调试结果，确认各自胶乳的稀释倍数。
取一定量的微球稀释液， 分别加入一定比例的AFB1 胶乳、DON 胶乳、ZEN 胶乳、IgY 胶乳，充分混合后，即得ADZ 胶乳。
2.2 荧光定量快速检测卡的制备
2.2.1 ADZ 胶乳结合垫的制备
在45%~65%的湿度和18~26 ℃的温度下，将ADZ 胶乳用峰航划膜喷金仪喷涂于结合垫上，喷膜量4~8 μL/cm，喷完后在该环境下继续平铺放置4~6 h， 后转入提前设置37 ℃的鼓风干燥箱内干燥4h，干燥保存备用。
2.2.2 ADZ 包被抗原大卡的制备
定义140 膜靠近吸水纸端为上端， 分别在140NC 膜距离上端 4 mm、8 mm、12 mm、16 mm、20mm 处依次为 C、T1、T2、T3 线。
将 140 NC 膜贴于PVC 胶板上， 于45%~65%的湿度和18~26 ℃的温度下平衡2 h。
用XYZ 3060 划膜仪分别在NC 膜上的 C、T1、T2、T3 线处， 依次包被已用抗原稀释液稀释到0.1~0.2 mg/mL 的黄曲酶毒素B1 抗原、呕吐毒素抗原、玉米赤霉烯酮抗原，包被量为0.5~0.8 μL/cm。
包被结束后，在该环境下干燥4~6 h，后转入提前设置37 ℃的鼓风干燥箱内干燥72 h， 干燥保存备用。
2.2.3 ADZ 荧光定量快速检测卡的组装
在10%~30%的湿度和18~26 ℃的温度下，在长8 cm 的ADZ 大卡上，依次搭接样品垫、ADZ 胶乳结合垫、吸水纸，切成4 mm 宽的细条，放入塑料卡壳中，用压壳机压紧，装入铝箔袋中，加入1 包1 g 的干燥剂，密封保存即可。
2.3 样本的检测
2.3.1 样本前处理
取有代表性的待测样品（玉米、小麦、大米、加工副产物等）500 g， 用小型粉碎机粉碎1 min 后过20目筛，收集过筛后的细小样品用于试验。称取过筛后的样品（5.00 g±0.03 g）于 50 mL 离心管中，量筒量取25 mL 样品提取液 （50%乙醇水+2%氯化钠），旋涡混匀器振荡提取3 min， 提取结束后， 离心机4000r/min 离心2 min，取上清液待用。
2.3.2 检测过程
取 100 μL 离心后上清液加入 1 000 μL 样品稀释液中， 用旋涡混匀器混匀3~5 s， 然后取100 μL加入到ADZ 荧光定量快速检测卡的加样孔中，水平放置于FD-2200 检测卡恒温孵育器上37 ℃恒温孵育8 min， 孵育器孵育8 min 结束后将检测卡插入FD-600 型荧光定量快速检测仪中，读数值即为样品的实际检测浓度值。
若检测浓度值大于设定的定量值时， 可用提取液将离心上清液稀释5 倍后再进行检测， 所得读数值乘以对应稀释倍数即为最终检测结果。
分别优化本项目中需要使用的时间分辨纳米微球的整个制备工艺、玉米赤霉烯酮（简称ZEN）的灵敏度低、黄曲霉毒素B1（简称AFB1）的均一性差、样本检测C 线线条扩散问题等等，分别进行了单因素实验。其中，荧光微球制备工艺的效果确定基于阴性样本检测的T 线荧光强度；
ZEN 灵敏度的最佳工艺的确定基于阴性样本T 线、C 线的荧光强度比值和不同浓度点的ZEN 阳性样本的竞争抑制率；
AFB1均一性优化的最佳工艺确定基于检测AFB1 不同浓度点的标准品的变异系数和检测卡展层；
样本检测C 线线条扩散问题的解决的最佳工艺的确定基于C值的波动情况；
3.1 灵敏度优化
3.1.1 高效率时间分辨荧光纳米微球探针的制备工艺优化
ADZ 荧光定量快速检测卡的标记工艺采用的是南京微测生物自主研发的时间分辨荧光纳米微球，通过对包裹技术的优化和改良，纳米微球中铕离子的密度可提升到20 万个/微球， 包裹完荧光离子后，在微球表面再进行葡聚糖修饰，大大提升了微球的稳定性和对可逆环境的抗干扰性，如图1。
南京微测生物的微球种类多，有不同粒径、不同表面羧基含量、不同长短的碳原子手臂等等，可选择性更多。
图1 时间分辨荧光纳米微球示意图
由于ADZ 荧光定量快速检测卡， 集AFB1 胶乳、DON 胶乳、ZEN 胶乳于一体，故胶乳量的多少对整个产品的均一性有很大的影响， 故选择荧光强度极高的荧光微球极为重要。
本项目对比了三家时间分辨荧光微球，都是包裹的稀土荧光离子铕，分别为赛默飞200 nm 微球、Bangs 200 nm 微球、南京微测生物210 nm 荧光微球。
用这三款微球分别标记了AFB1 胶乳、DON 胶乳、ZEN 胶乳。
3.1.2 时间分辨荧光纳米微球的选择
ADZ 荧光定量快速检测卡中ZEN 的灵敏度低，本项目进行了ZEN 灵敏度优化。选择了四个不同长短的碳原子手臂的210 nm 荧光微球进行实验对比， 分别选择 0 原子手臂、6 原子手臂、200 原子手臂、1 000 原子手臂的荧光微球。
3.2 均一性优化
ADZ 荧光定量快速检测卡采用的是干式免疫荧光侧向流层析法， 当时间分辨荧光胶乳随样本一起向上爬NC 膜时，其跑板的速度均一性、跑板时整个样本胶乳混合物的均一性都会影响到整个抗原与抗体结合的均一性，直接影响了T 线、C 线荧光值读数的均一性，从而影响了整个检测卡的性能，尤其是变异系数（CV）。ADZ 荧光定量快速检测卡在开发过程中，难点之一是黄曲霉毒素B1 的CV 优化，即均一性优化。
3.2.1 样品垫的选择
针对ADZ 荧光定量快速检测卡的AFB1 均一性差的问题，本项目进行了样品垫的选择。选择了美国奥斯龙的8964、上海捷宁生物的G-6、美国奥斯龙8965 这三款样品垫进行实验对比，主要考量爬条速度、前锋液流均一性等。
3.2.2 样品垫的优化处理
根据3.2.1 中选出的一款最佳样品垫，在此基础上，对比了几种样品垫缓冲液配方，主要改变了缓冲液中的糖量、表活量、蛋白量等。
本实验一共比较了三种配方， 对比三种缓冲液处理样品垫后对AFB1变异系数、图谱展层的优化效果。
3.3 准确度的优化
ADZ 荧光定量快速检测卡在检测部分样本的过程中， 发现了C 线线条扩散问题， 从而影响了C线荧光读值，C 值忽高忽低，波动较大，进一步影响到样本准确度。本项目从原稀释液方面进行了优化，从C 值强弱等角度考量。
3.3.1 抗原稀释液
抗体/抗原划膜稀释液的选择也极为重要，本项目尝试了三种缓冲体系的C 线抗体划膜稀释液，分别是碳酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸钠缓冲液。
4.1 灵敏度优化
4.1.1 高效率时间分辨荧光纳米微球探针的制备工艺优化
本项目对比了三家时间分辨荧光微球， 都是包裹的稀土荧光离子铕，分别为赛默飞200 nm 微球、Bangs 200 nm 微球、 南京微测生物210 nm 荧光微球。
用这三款微球分别标记了AFB1 胶乳、DON 胶乳、ZEN 胶乳。
取一定量的微球稀释液，分别加入一定比例的 AFB1 胶乳、DON 胶乳、ZEN 胶乳、IgY 胶乳，充分混合后，即得ADZ 胶乳，将ADZ 胶乳喷涂在结合垫上，烘干后，与ADZ 大卡匹配后检测。如图2， 从左往后， 依次是赛默飞 200 nm 微球、Bangs 200nm 微球、南京微测生物210 nm 荧光微球的阴性样本的检测卡的紫外照射图， 从图中可以明显看出T 线的荧光强度从左往右依次增强， 尤其是南京微测生物210 nm 荧光微球的T 线荧光最强最亮。
图3 显示的是图2 中三条检测卡对应的检测图谱， 图谱中可以看到 T1 值、T2 值、T3 值、C 值，从左往右， 依次是赛默飞200 nm 微球、Bangs 200 nm微球、 南京微测生物210 nm 荧光微球的阴性样本的检测卡的检测图谱，同样，直观地看出，南京微测生物210 nm 荧光微球的信号最强。
南京微测生物自主研发了增强型时间分辨荧光微球， 标记效率提高了3 000 倍以上， 对于真菌毒素三合一检测卡的性能而言，一是可以提高效价与灵敏度，二是可以用更少的标记抗体荧光胶乳，有助于均一性的改善。
图2 采用不同制备工艺的荧光微球的ADZ 检测卡紫外照射图
图3 采用不同制备工艺的荧光微球的ADZ 检测卡检测图谱
4.1.2 时间分辨荧光纳米微球的选择
南京微测生物基于自主研发的高效率增强型的时间分辨荧光微球的工艺上，进一步进行了改良，在微球表面分别修饰了不同长度的碳链， 做出不同碳原子手臂的时间分辨荧光微球， 给不同产品提供了微球多样性选择， 满足了不同产品或者同一产品不同性能需求的工艺优化。
从理论上讲， 原子手臂越长，标记抗体与微球间的空间位阻将大大减少，有助于提高标记抗体的偶联效率。但是，具体使用效果还需结合不同项目具体对比分析。
表1 中对比了南京微测生物的4 种不同数量的碳原子手臂的荧光微球标记ZEN 胶乳的不同浓度点的阳性样本与阴性样本的竞争抑制率， 分别选择0 原子手臂、6 原子手臂、200 原子手臂、1000 原子手臂的荧光微球。
从表1 中的数据得出：0 原子手臂的灵敏度最低，其50μg/kg 的样本抑制率才26.5%；
200 原子手臂的灵敏度最强， 其 10 μg/kg 的样本抑制率已经达21.49%，且从整体T/C 值的分布看，200 原子手臂的拉开幅度更开，10~1 000 μg/kg 抑制率达21.49%~96.47%；
1 000 原子手臂的T/C 值拉开幅度虽然也很开，10~1 000 μg/kg 抑制率达 12.73%~96.36%，但是灵敏度不如200 原子手臂的。本项目中ZEN 胶乳标记工艺中最终选择了南京微测生物的200 原子手臂的时间分辨荧光微球。
表1 碳原子手臂的时间分辨荧光微球对ZEN 灵敏度的影响
4.2 均一性优化
4.2.1 样品垫的选择
样品垫在免疫层析方法学中的主要作用就是起到过滤样本、缓冲样本、调节样本流速等作用，研发人员还会根据产品的特性，对样品垫进行预处理，保证样本在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性的吸附或者改变样本的性质。
本项目对比了美国奥斯龙的8964、上海捷宁生物的G-6、美国奥斯龙的8965 这三款样品垫的爬条速度、前锋液流均一性等，结果见表2 与图4。
从表2 中可以得出，上海捷宁生物的G-6 的跑条时间最短，爬完窗口用时47 s；
其次是美国奥斯龙的8964，用时52 s；
最后是美国奥斯龙的8965，用时最长，达1 min 4 s 。
表2 不同样品垫的爬条时间
图4 是采用不同样本垫的ADZ 荧光定量快速检测卡，同时加样爬条，爬条20 s 时的爬条速度直观图。从图4 也能看出，图中从左到右依次是用了美国奥斯龙的8964、上海捷宁生物的G-6、美国奥斯龙的8965 样品垫， 可见上海捷宁生物的G-6 的爬条速度最快，且其前锋液流比较均一，未出现锯齿状的前锋。所以ADZ 荧光定量快速检测卡采用了上海捷宁生物的G-6 样品垫。
图4 不同样品垫的爬条速度直观图
4.2.2 样品垫的优化处理
在上海捷宁生物G-6 样品垫的基础上，对样品垫缓冲液进一步优化。免疫层析中，糖量对改善胶乳的残留问题有一定的效果， 使得胶乳能够完全地释放到NC 膜上；
表面活性剂， 可以改变一定的疏水性，让层析过程更加均一；
惰性蛋白（如BSA、酪蛋白等）起到封闭的作用，可以流动中封闭，大大减少非特异性吸附。
本项目从糖量、表面活性剂量、蛋白量三个角度进行了样品垫缓冲液配方优化。
表3 中共列了三个样品垫缓冲液配方，配方1 中无蛋白，配方2 中无蔗糖， 配方3 在配方2 的基础上加大了表面活性剂量。
表3 三种样品垫缓冲液配方表
用以上3 种样品垫缓冲液配方处理上海捷宁生物G-6 样品垫，烘干后，对比了对检测卡的展层图谱，如图 5、图 6、图 7。
对比 3 张图的曲线平整度，显而易见，图7 中配方3 的展层最平整，基线较平滑；
而图5 的配方1 的展层左边上扬， 说明胶乳在检测时间8 min 到达时还未爬完NC 膜，爬速略慢；
图6的配方2 的展层虽然整体看平整， 但是在两个峰之间的基线不平整， 说明胶乳在两条包被线之间分布不均，展板不均一；
这些因素都会体现在检测卡的变异系数（CV）上。
图5 样品垫缓冲液配方1 展层图谱
图6 样品垫缓冲液配方2 展层图谱
图7 样品垫缓冲液配方3 展层图谱
将上面3 种样品垫缓冲液配方的样品垫分别贴于黄曲霉毒素B1 的检测卡上进行变异系数比较，检测黄曲霉毒素 B1 的 5、10、25、50 μg/kg 浓度点的标准品，记录 C 值、T 值，计算 T/C 值、T/C 值的变异系数（CV），结果见表 4。
表4 三种样品垫缓冲液配方的变异系数对比
由表4 中黄曲霉毒素B1 的4 个标准品浓度点的变异系数大小比较后得出， 配方3 的每个浓度点的变异系数最小，配方1 的变异系数最大。故本项目中样品垫缓冲液配方选择配方3。
4.3 准确度优化
4.3.1 抗原稀释液
本项目在开发过程中，发现了C 值波动巨大的问题，一是影响了检测卡的均一性，二是严重影响了检测的准确度，针对这一问题，研发人员从抗原稀释液种类进行了优化， 本项目尝试了三种缓冲体系的C 线抗体划膜稀释液，分别是碳酸缓冲液（CBS）、磷酸缓冲液（PBS）、柠檬酸钠缓冲液（NMS），对比了50mM CBS+5%蔗糖、50mM PBS+5%蔗糖、50mM NMS+5%蔗糖这三种抗原划膜液的C 值波动情况，结果见图8。
由图8 中的3 条曲线， 很直观地看出50mM PBS+5%蔗糖的C 值曲线波动很平缓，50mM CBS+5%蔗糖的C 值波动幅度大。
故本项目选择50mM PBS+5%蔗糖的抗原稀释液。
图8 抗原稀释液对C 值的影响
本文成功优化了一种快速、简易、省时省力地检测粮食谷物中的黄曲霉毒素B1/呕吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素三合一荧光定量快速检测卡。
该方法用时间分辨荧光微球分别标记曲霉毒素B1/呕吐毒素/玉米赤霉烯酮单克隆抗体作为分析探针，黄曲霉毒素B1/呕吐毒素/玉米赤霉烯酮抗原偶联物作为竞争抗原，以羊抗鼠IgG 作为控制抗体，进行黄曲霉毒素B1/呕吐毒素/玉米赤霉烯酮的检测分析。
该方法快速便捷，一次提取，一次检测，8 min 内即可得到3个项目的检测结果。
利用荧光微球的光电信号的强弱，可进行定量检测。
本项目成功优化了黄曲霉毒素B1/呕吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素三合一荧光定量快速检测卡的时间分辨纳米微球的整个制备工艺、 玉米赤霉烯酮（简称ZEN） 的灵敏度低、 黄曲霉毒素 B1 （简称AFB1）的均一性差、样本检测C 线线条扩散等问题。通过对微球制备工艺、 微球表面修饰不同数量碳原子手臂， 确认了ADZ 检测卡中ZEN 胶乳所用的荧光微球， 即南京微测生物的200 原子手臂的时间分辨荧光微球，解决了ZEN 灵敏度低的问题；
通过对样品垫的选择、样品垫缓冲液配方的优化，确认了样品垫工艺，即用上海捷宁生物的G-6 玻纤垫，并处理样品垫缓冲液配方3， 解决了AFB1 均一性差问题；
通过对抗原稀释液优化，确认用50mM PBS+5%蔗糖划膜液，解决了样本C 线线条扩散问题。