张 权，江 旭，赵宇艳，杨加伟
(1.遵义医科大学 生物化学教研室，贵州 遵义 563099; 2.遵义医科大学 贵州省普通高等学校脑科学特色重点实验室,贵州 遵义 563099)
甲硫氨酸亚砜还原酶(Msr)作为生物催化剂在制备单一构型的手性亚砜及药物方面的应用正经历快速的发展。它是催化游离或多肽链中的甲硫氨酸亚砜(Met-O)还原为甲硫氨酸(Met)的一类酶[1-3]。这一家族的酶可以修复由活性氧引起的甲硫氨酸残基氧化成甲硫氨酸亚砜造成的蛋白质损伤，在保护细胞免受氧化损伤中起着重要作用。Met-O中的硫是手性中心，Met在体内被活性氧(ROS)氧化成Met-O，生成Met-O的两个同分异构体，称为Met-R-(O)和Met-S-(O)[4]。目前报道的Msr[5-6]可分为MsrA、MsrB、fSMsr和fRMsr等，MsrA的研究较为普遍，MsrB基因存在于原核生物和真核生物的基因组中，但与MsrA没有序列相似性。MsrA和MsrB在降低Met-O方面表现出相反的立体选择性。在硫氧还蛋白(Trx)及硫氧还蛋白还原酶(TrxR)等辅酶的存在下，MsrB和fRMsrB催化消旋体亚砜中的(R)构型Met-O还原成Met，催化活性较低；
而MsrA和fSMsrA则催化消旋体亚砜中(S)构型Met-O还原成Met，催化活性较高。此外，Msr可以借助二硫苏糖醇(DTT)[7]立体特异性地将消旋体亚砜还原为相应的异构体[8-9]。
手性亚砜是一类含有亚硫酰基(>S=O)官能团的重要有机化合物[3]，是很多药物如抗高血压药物钾离子通道激活剂Aprikalim、治疗和缓解十二指肠溃疡的质子泵抑制剂埃索美拉唑、血小板粘附抑制剂OPC-29030、治疗嗜睡症及抗抑郁的阿莫达非尼等的关键组成部分[10-11]。生物催化领域的下一个突破是开发定向进化方法，利用生物酶选择性地催化合成单一构型的手性化合物是目前的研究热点，但能同时满足两种或两种以上的催化条件的生物酶依然十分匮乏[12-13]。本研究在前期工作中，从1株假单胞菌中筛选出了1个MsrA基因并命名为pmMsrA[13- 14]。利用MsrA重组蛋白为催化剂，在底物浓度高达200 mmol的情况下，实现(R)-亚砜的不对称拆分合成[15]；
进一步研究中，课题组[16]发现了1种MsrA的同系物paMsrA，利用重组的paMsrA蛋白催化外消旋亚砜的不对称还原拆分，以约50%的产率和99%的对映体过量制备了(R)构型的手性亚砜，更重要的是，在底物初始浓度高达320 mmol(约45 g/ L)的条件下，动力学拆分获得了较高的对映体选择性；
此外，课题组[17]还报道了1种甲硫氨酸亚砜还原酶B(MsrB)酶体系，在初始底物浓度为50 mmol时，通过动力学拆分制备了对映体过量为93%～98%的(S)-亚砜。但是，Msr的底物普适性较窄，底物耐受能力及稳定性还有待提高，酶促反应受底物的限制较大等不足，需要对酶进行改造和优化[15]。
目前对酶分子的改造主要以定向进化、理性设计和半理性设计3种策略居多[18-19]。定向进化这项技术是通过对蛋白酶基因序列中的碱基进行易错PCR、DNA改组、定点饱和突变等随机突变，导致氨基酸随机变化的迭代循环，然后选择或高通量筛选产生的变异文库，以提高酶的稳定性、底物特异性和对映选择性等的一种技术。该技术作为改造蛋白酶的常用策略，已从酶分子的改造领域逐渐拓展到医药行业及工农业等相关产业中[20]。由于定向进化技术需要对突变体库进行大量的筛选，而筛选仍然是制约酶定向进化改造的瓶颈[21-22]。为解决这一难题，建立一种简便的高通量定向进化蛋白酶的筛选方法尤为重要。研究表明，生物酶在催化反应时往往需要有机小分子化合物作为辅因子，Msr在细胞内的活性再生需要NADPH供氢，催化反应后Msr会形成分子内二硫键，Trx可将其还原，被氧化的Trx再在NADPH和TrxR的催化下被还原，我们可以监测NADPH在340 nm波长的吸光度值减少量来间接判断Msr的酶活性。因此，本研究通过酶的一系列级联催化反应，拟建立1种Msr的高通量活性筛选体系，为其定向进化研究奠定基础。
1.1 主要仪器和材料 BioSpectrometer basic分光光度计(德国Eppendorf公司)、气相色谱(美国Agilent Technologies公司)、全波长酶标仪(美国Thermo Scientific公司)、手性液相色谱(大连依利特分析仪器有限公司)；
MsrA、MsrB、Trx和TrxR重组表达载体的菌株由本课题组前期构建[13]。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)购于生工生物工程(上海)股份有限公司、苯甲亚砜购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌培养与蛋白表达 从-80 ℃冰箱分别取出保存的含MsrA、MsrB、Trx、TrxR重组表达载体的甘油菌及空载体pET-28a甘油菌，划平板后置于37 ℃恒温箱培养过夜。用灭菌牙签挑取单克隆于5 mL含Kan的LB液体培养基中。37 ℃、210 rpm恒温摇床上培养8 h，然后按照1∶100的比例接种到100 mL LB液体培养基中，并在同样的条件下培养至OD600为0.8，加入适量的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，至终浓度为0.2 mmol，20 ℃ 150 rpm诱导培养16～18 h。
1.2.2 重组菌细胞裂解 诱导结束，4 000 rpm离心10 min收集菌体，加入适量的PB(50 mmol，pH 8.0)重悬菌体，再加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，低温缓慢摇动1 h后，超声破碎，60 W功率超声开1 s，关2.5 s，持续7 min。然后，4 ℃、12 000 rpm离心10 min，收集粗酶，用分光光度计测粗酶浓度，PB稀释成终浓度为5 mg/mL后置于冰上待用。
1.2.3 粗酶催化反应 取3个25 mL容量的三角锥形反应瓶，做5 mL反应体系，酶的终浓度均为5 mg/mL。分别加入MsrA+Trx+TrxR+NADPH(5 mM)、MsrA+Trx+TrxR+苯甲亚砜(10 mM)、MsrA+Trx+TrxR+苯甲亚砜+NADPH。封闭瓶塞后放入30 ℃恒温摇床中，250 rpm反应1.5 h。反应结束后，加入5 mL乙酸乙酯终止反应，摇床中萃取10 min，倒入离心管中，4 000 rpm离心10 min，离心分层后吸取上层有机相到装有少许无水硫酸钠的2 mL离心管中，反复颠倒混匀使有机相中的水分和杂质被吸附，再用注射器和有机滤膜过滤样品，稀释后用于气相色谱及手性液相色谱检测苯甲亚砜转化率及对映体过量。
1.2.4 NADPH在不同催化反应时间的吸光度测定 重复1.2.3三组实验，在0～28 min内，每间隔4 min吸取8 μL反应液，用BioSpectrometer basic分光光度计检测NADPH在340 nm的吸光度值。
1.2.5 重组菌株96孔微孔培养与蛋白表达 向96孔深孔培养板中加入0.3 mL含Kan的LB培养液，用灭菌牙签挑入MsrA单克隆菌株到88个孔中。向剩余的8个培养孔中挑入pET-28a空载体对照菌。在37 ℃摇床，250 rpm培养12 h后，再次加入 0.7 mL含相应抗性和IPTG的新鲜LB培养液，置于20 ℃，250 rpm继续诱导24 h。将96孔深孔培养板置于离心机内，4 000 rpm离心15 min，收集菌体。
1.2.6 微孔重组菌细胞裂解 将诱导表达的微孔重组菌置于-80 ℃冷冻过夜，然后每孔加入0.4 mL细胞裂解液(50 mmol磷酸缓冲液，pH 8.0，1 mg/mL溶菌酶，5 μg/mL DNA酶I)，充分震荡悬浮菌体，低温缓慢震荡裂解6 h。然后在4 ℃，4 000 rpm离心20 min，上清液即为含MsrA重组蛋白及空载体蛋白的粗酶液。
1.2.7 MsrA活性测定 对应转移0.15 mL粗酶液到96孔酶标板中，加入0.05 mL底物反应液(50 mmol磷酸缓冲液，pH 8.0、10 mmol苯甲亚砜、5 mg/mL Trx和TrxR、5 mmol NADPH)，用Multiskan GO全波长酶标仪测定各个样品孔在0～50 min内的OD340吸光度值。用空载体与样品的OD340差值来衡量MsrA重组蛋白的活性。
1.2.8 MsrB的催化反应及活性测定 采用上述相同实验方法，仅将MsrA换成MsrB，检测苯甲亚砜的转化率和ee值，并构建MsrB+Trx+TrxR+NADPH的微量级联催化反应系统，监测MsrB的酶活性。全波长酶标仪的检测时间延长到75 min。
2.1 NADPH参与MsrA催化消旋体亚砜生成硫醚 MsrA能将消旋体苯甲亚砜中的(S)构型亚砜转化为硫醚，保留(R)构型亚砜(见图1A)。在没有NADPH存在的条件下，MsrA对消旋体苯甲亚砜的活性很低，转化率仅仅为6.63%，当反应体系中加入NADPH后，硫醚的产率明显升高，转化率提升到43.85%(见表1、图1B、C)。从手性液相色谱图也能看出，(S)构型苯甲亚砜明显降低，ee值从6.06%提升到54.43%(见图1D、E)，说明NADPH参与MsrA催化消旋体苯甲亚砜生成苯甲硫醚，而且MsrA的选择性以(S)构型亚砜为主。
表1 NADPH参与MsrA催化消旋体苯甲亚砜生成苯甲硫醚的转化率及ee值
2.2 NADPH随着催化反应时间的延长而逐渐被消耗 由于NADPH在340 nm有吸收峰，而反应后的NADP+没有吸收峰，通过测定NADPH在340 nm处的OD值变化可反应酶活力。反应体系混合后立即检测NADPH吸光度值，每间隔4 min检测一次(见图2)：MsrA+Trx+TrxR+NADPH组在0～28 min内OD值缓慢下降；
MsrA+Trx+TrxR+苯甲亚砜组在0～28 min内OD值都较低；
MsrA+Trx+TrxR+苯甲亚砜+NADPH组在0～12 min内吸光度值急速下降，在12～28 min内趋于平缓，说明NADPH几乎被消耗殆尽。当反应体系内不加入NADPH，OD值都较低，在0～28 min内微微上升，可能是由于酶变性导致；
与不加NADPH对比，反应开始OD值明显较高，当反应体系内含有底物苯甲亚砜，随着反应时间的延长，OD值显著下降，直至12 min消耗殆尽；
当反应体系内不含底物苯甲亚砜，OD值缓慢下降，说明空载体可能表达少量的MsrA酶，另外，NADPH也不仅仅只作用于MsrA酶，体系中可能还存在其它的酶在缓慢的消耗NADPH。通过比较发现，NADPH随着级联反应时间的延长而逐渐减少，NADPH的消耗主要是由MsrA引起。
图2 0～28 min内NADPH的OD340值变化情况
2.3 MsrA高通量活性筛选微量体系的建立 基于对突变文库筛选既多又准的考虑，选用单孔容积为2 mL的96孔深孔培养板，其优势在于广泛的高通量筛选。为减少96孔板不同培养孔中由于细菌生长差异而导致的酶量差异，本研究先在96孔中加入0.3 mL含Kan的培养基。将含MsrA重组质粒的菌株单克隆依次挑取至88个培养孔中，再挑入pET-28a到剩余8个孔中，37 ℃过夜培养细菌使其达到饱和，再加入0.7 mL含Kan和诱导剂(IPTG)的新鲜培养基，诱导重组蛋白表达，离心后收集菌体并裂解细胞获得粗酶液，粗酶液和反应液混合后立即用全波长酶标仪检测，每间隔2分钟检测1次(见图3A)：所有孔均能检测到NADPH的光吸收，且在前30 min内的OD值差异不明显。30 min过后，实验组NADPH的OD值开始缓慢下降，在38 min后显著下降，44 min后趋于平缓；
pET-28a在40 min后微微下降，42 min后显著下降，44 min后下降趋势放缓。两组相比，MsrA与pET-28a在第44分钟间隔最大。结果进一步证明空载体pET-28a和MsrA所产生的酶都在消耗NADPH，但MsrA消耗NADPH更为明显；
同时，经过数据分析(见图3B、C)，所有样品的差异系数在前30 min内的最大差异系数仅为1.26%，30 min到48 min时间内，在第44分钟间隔最大，此时MsrA的差异系数为10.64%。较低的差异系数体现各个培养孔中酶的活性相差很小，说明细菌生长及蛋白表达一致性较好。
A：微量反应体系内NADPH的OD340值变化情况；
B：88孔MsrA蛋白酶在30 min和44 min的酶活性，虚线表示样品的酶活平均值；
C：8孔pET-28a蛋白酶在30 min和44 min的酶活性；
D：级联催化反应30 min与44 min的酶活性平均值统计结果；
*：P<0.01；
n1=88(MsrA)，n2=8(pET-28a)。
本研究对两个差异系数时间点进行统计学分析，结果(见图3D)所示，与不含重组蛋白的空载体pET-28a相比，含MsrA重组蛋白的混合液随着时间的延长，NADPH的OD340值明显降低(P<0.01)，这是MsrA+Trx+TrxR+NADPH级联催化反应的结果，可以作为MsrA活性筛选的快速指标。
2.4 NADPH参与MsrB催化消旋体亚砜生成硫醚 将MsrA换成MsrB，MsrB能将消旋体苯甲亚砜中的(R)构型亚砜转化为硫醚，保留(S)构型亚砜(见图4A)。在没有NADPH存在的条件下，MsrB对消旋体苯甲亚砜的活性很低，转化率仅仅为17.34%，当反应体系中加入NADPH后，硫醚的产率明显升高，转化率提升到47.41%(见图4B、D，表2)。从手性液相色谱图也能看出，(R)构型苯甲亚砜明显降低，ee值从9.26%提升到61.50%(见图4C、E，表2)，说明NADPH不仅参与MsrB催化消旋体苯甲亚砜生成苯甲硫醚，而且MsrB的选择性以(R)构型亚砜为主。
A：MsrB催化消旋体苯甲亚砜生成(S)构型手性亚砜和苯甲硫醚示意图；
B：MsrB+Trx+TrxR+苯甲亚砜的气相色谱；
C：MsrB+Trx+TrxR+苯甲亚砜的手性液相色谱；
D：MsrB+Trx+TrxR+苯甲亚砜+NADPH的气相色谱；
E：MsrB+Trx+TrxR+苯甲亚砜+NADPH的手性液相色谱。
表2 NADPH参与MsrB催化消旋体苯甲亚砜生成硫醚的转化率和ee值
2.5 MsrB高通量活性筛选微量体系的建立 采用相同的方法诱导细菌表达得到粗酶，粗酶液和反应液混合后立即用全波长酶标仪检测，每间隔5分钟检测一次(见图5A)：所有孔均能检测到NADPH的光吸收，且在前10 min内的OD值差异不明显。10 min过后，实验组NADPH的OD值开始显著下降，50 min后下降趋势放缓；
pET-28a在30 min后开始逐渐下降，65 min后下降趋于平缓。两组相比，MsrB与pET-28a在第50 min间隔最大。结果进一步证明空载体pET-28a和MsrB所产生的酶都在消耗NADPH，但MsrB消耗NADPH更为明显；
同时，经过数据分析(见图5B、C)，所有样品的差异系数在前10 min内的最大差异系数仅为1.22%，10 min到75 min时间内，在第50 min间隔最大，此时MsrB的差异系数为4.10%。较低的差异系数体现各个培养孔中酶的活性相差很小，说明细菌生长及蛋白表达一致性较好。本研究对两个差异系数时间点进行统计学分析，结果(见图5D)所示，与不含重组蛋白的空载体pET-28a相比，含MsrB重组蛋白的级联催化系统随着时间的延长，NADPH 的OD340值显著降低(P<0.01)，这是MsrB+Trx+TrxR+NADPH级联催化反应的结果，可以作为MsrB活性筛选的快速指标。
A：微量反应体系内NADPH的OD340值变化情况；
B：88孔MsrB蛋白酶在10 min和50 min的酶活性，虚线表示所有样品的酶活平均值；
C：8孔pET-28a蛋白酶在10 min和50min的酶活性；
D：级联催化反应10 min与55 min的酶活性均值统计结果，*：P<0.01；
n1=88(MsrB)，n2=8(pET-28a)。
本研究成功建立了MsrA/MsrB高通量酶活性级联催化筛选方法(见图6)，该方法操作简便，假阳性率较低，重复性好。通过NADPH在340 nm的吸光度值减少量，实时检测MsrA/MsrB的活性，可用于MsrA/MsrB突变株的高通量筛选研究。
图6 Msr的简单高通量活性级联催化筛选系统
酶的定向进化技术是对生物酶的基因进行单点或多点突变以提升其催化性能的有效手段，在实际操作中，对大量突变体样本的筛选往往得不到活性提升的突变体，从而制约后续酶学性质的研究。另外,在生物转化反应的过程中,酶所处的环境对于其活性的影响较大,如反应的温度、pH值、反应介质等不适都会使酶的催化活性降低,甚至失去催化活性[23]。因此，建立合适的高通量活性筛选体系是利用定向进化技术对酶进行改造的基础。本研究目前的方法是基于MsrA/MsrB+Trx+TrxR+NADPH级联催化体系里面的一些列氧化还原反应，应该强调的是，虽然使用的是MsrA、MsrB、Trx和TrxR还原酶，但该分析涉及一个级联催化系统，Msr在反应体系内的活性再生需要NADPH供氢。Msr催化底物反应后自身会形成分子内二硫键，Trx可将其还原，其中还原的Trx是使用NADPH和TrxR还原酶产生的。因此，检测到的任何活性化合物都必须进行测试，以确保它们不会影响Trx系统的活性。这很容易通过建立不含MsrA/MsrB的Trx还原酶实验来实现，其中使用氧化Trx的底物水平，因此NADPH的氧化仅依赖于Trx的还原。在这些条件下，NADPH氧化的任何增加或减少都表明该化合物正在影响Trx反应，而Trx的氧化才反应Msr活性。值得注意的是，反应体系中Msr、Trx和TrxR还原酶，影响这些成分中任何一种活性的化合物可能会干扰结果[7]。课题组前期通过易错PCR随机突变获得了MsrA和MsrB突变体文库，本研究接下来需分别对MsrA突变株、MsrB突变株进行大规模筛选，以进一步提升其催化性能，为将来制备单一构型手性亚砜药物以及工农业应用打下基础。目前对 MsrA酶活性的筛选主要有气相液相色谱法[16]，荧光探针法[22]，DTT-DTNB显色法[4]，基于人工智能的计算机辅助蛋白质设计改造筛选法[24]等，这些方法都有相应的缺点，比如气相液相色谱法耗时且效率低，不能满足高通量大规模筛选的要求；
荧光探针法，通常一种荧光探针只能筛选一种构型的底物，不同的底物需要合成不同的荧光探针，合成探针费用昂贵；
DTT-DTNB显色法，DTT本身可能会被空气中的氧气氧化，从而导致DTT消耗量的非酶性增加，造成大量的假阳性，同时，DTT的反应需要在一定时间后停止反应，而反应停止的最佳时间往往不好把握；
人工智能筛选不仅要求很高的跨学科专业背景，同时还设计一些自主知识产权的卡脖子技术难题。因此，课题组便开展了MsrA/MsrB酶活性高通量筛选体系的研究。由于文献中使用是较高浓度的MsrA纯酶，并不确定是否适用于MsrA粗酶液。特别是本研究的96孔微量培养体系中，MsrA/MsrB 酶的含量非常低。因此，本研究在上述筛选方法基础上进行了进一步的摸索。通过优化NADPH参与硫氧还蛋白系统的级联反应，最终借助全波长酶标仪，实现了Msr酶活性的实时监测，该方法不仅适用于苯甲亚砜，还适用于其它底物的高通量筛选。
综上所述，本研究测得NADPH参与MsrA/MsrB催化消旋体亚砜还原成硫醚，96孔板中MsrA/MsrB酶活性一致性均较好，能满足后续底物谱、底物耐受能力、稳定性等定向进化改造研究的高通量筛选需求。本研究成功建立了适用于定向进化改造的MsrA/MsrB酶活性高通量筛选的MsrA/MsrB+Trx+TrxR+NADPH级联系统。
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