孙蕾，韩瑨烜，梁秋艳
（新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院/国家农副产品质量监督检验中心（新疆），乌鲁木齐 830011）
2021年国家农产品质量安全例行监测结果显示，农产品例行监测合格率97.6%，其中水果抽检合格率96.5%。在对葡萄进行专项质量监测抽样时，检出克百威（包括3-羟基克百威）氨基甲酸酯类农药残留不合格。近几年来，我国葡萄种植面积和产量保持持续增长，是世界葡萄生产和消费大国。新疆是中国的第一葡萄产区，特别是‘无核白’葡萄，主要集中在吐鲁番地区，年产量超100万吨，远销国内外[1-2]。随着我国经济持续高速发展，人们对好看、好吃、好运的“三好”优质葡萄需求不断增加。然而，葡萄病虫害种类繁多，伴随化学防治而来的农药滥用及高残留等一系列问题关乎到葡萄产品品质。为满足消费者多样化和个性化消费需求及对产品品质更高层次的追求，葡萄产业须加快由数量型向质量型转变[3-5]。
我国对于葡萄的农药残留限量要求较严格，在GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[6-7]中，针对葡萄的农残限量要求多达213项，其中对氨基甲酸酯类农药的数量和限量做了严格要求。氨基甲酸酯类农药[8-10]是一类以甲酸酯为前体化合物开发而来的广谱性杀虫、杀螨、杀线虫剂，不仅具有触杀作用，并具有很强的内吸活性，例如，克百威、丁硫克百威、涕灭威等。少量的农药残留不会导致急性中毒，但长期大量食用农药残留超标的水果可对人体健康产生不同程度的影响。
‘无核白’葡萄从小苗开始的叶检，到成熟上市前的果检，全程监控，至少有10次以上。由于其产量高，销量大，快速准确测定其氨基甲酸酯类农药残留显得尤为重要[11-15]。本文通过实际检测经验，简化前处理步骤，优化操作过程，通过回收率等实验验证，建立了简便、快速，精密度和准确性较高的氨基甲酸酯类农药残留的检测方法，为葡萄产业节本、优质、高效和绿色发展提供质量安全保证的技术手段[16-19]。
1.1 材料与试剂
原料：市售无核白葡萄样品。
试剂：10种氨基甲酸酯农药标准品（克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威亚砜、涕灭威砜、速灭威、灭多威、甲萘威、仲丁威、异丙威）规格：1000.0 μg·mL-1，来自坛墨质检科技股份有限公司；
氢氧化钠溶液、OPA试剂均来自美国Pickering科技有限公司；
乙腈、甲醇均为色谱纯，美国Sigma公司；
水为去离子水。
1.2 仪器与设备
仪器：高效液相色谱仪，日本岛津公司；
VORTEX2涡旋振荡器，德国IKA集团；
刀式研磨仪，德国Retsch GM200；
柱后衍生仪Vector PCX，美国Pickering科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液的配制
吸取1 mL标准品，用甲醇稀释定容至50 mL，即得到浓度为20 μg·mL-1的标准贮备溶液，将其置于﹣18 ℃冰箱中保存。使用前再用甲醇稀释成所需的标准工作液。
1.3.2 OPA配制
称取15 mg邻苯二甲醛（OPA），溶于50 mL甲醇中，得到A液；
称取3.34 g硼酸和0.18 g氢氧化钠，溶于400 mL纯水中，得到B液；
将A液和B液混合，过滤，脱气后加入11 μL 2-巯基丙酸，充分混合后备用，临用现配。
1.3.3 样品处理
取葡萄样品的可食部分，经刀式研磨仪匀浆制成待测试样。准确称取20.0 g试样置于离心管中，加入40 mL乙腈，再加入氯化钠6 g，剧烈振摇1 min，超声提取20 min，4500 r·min-1冷冻离心10 min，吸取上层溶液过0.45 μm微孔滤膜后，待高效液相色谱仪测定。
1.3.4 液相洗脱条件
色谱柱Shimadzu Shim-pack XR-ODS（75 mm×4.6 mm, 2.2 μm），柱温50 ℃，进样体积5 μL；
荧光检测器，发射波长330 nm，激发波长465 nm；
梯度洗脱条件0～5 min，甲醇8%；
6 min，甲醇35%；
11 min，甲醇45%；
15～16 min，甲醇80%；
16.01～18 min，甲醇8%，流速保持0.5 mL·min-1。
1.3.5 柱后衍生条件
2 g·L-1氢氧化钠溶液，流速0.5 mL·min-1；
OPA试剂，流速0.5 mL·min-1；
反应器温度为水解温度100 ℃，衍生温度为50 ℃。
2.1 净化方式优化
由于本试验所采用的葡萄样品经研磨匀浆、离心后获得上层清液后，观察其外观发现，清液颜色浅、清澈、表面无油污状漂浮物，故样品中色素、油酯类等干扰杂质较少。再通过高效液相色谱仪对经1.3.3制备的加标样品溶液（加标浓度0.15 μg·mL-1）进行分析，获得10种氨基甲酸酯类农药在样品中的液相色谱图（图1），发现样品中杂质干扰峰出现在2.3 min左右，目标峰均在6 min之后出峰，且各组分分离度较好，因此可以说明样品基质对试验中氨基甲酸酯类农药的定性分析不存在影响，因而本实验采用乙腈直接提取的方法对样本进行处理。在定量方面，可以考虑采用配制空白基质标准曲线对待测组分含量进行校准，避免因基质效应引发的定量不准确。
2.2 液相色谱条件优化
采用1.3.4的液相色谱条件，10种氨基甲酸酯类农药可以完全分离，且峰型良好，分析时间较短。其中涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威、仲丁威的保留时间分别为5.936、7.157、8.399、9.850、11.424、12.238、13.647、14.235、15.327、16.292 min（图1）。
图1 10种氨基甲酸酯类（0.15 μg·mL-1）农药样品色谱图Figure 1 Chromatogram of 10 carbamate pesticides (0.15 μg·mL-1)
2.3 标准曲线、线性范围及检出限的测定
在0.05～2.00 μg·mL-1线性范围内，10种农药浓度对应峰面积有良好的线性关系，以峰面积Y对浓度X进行线性回归，相关系数均大于0.9990。以基线噪声（S＝3N）确定检出限，得出10种氨基甲酸酯农药的方法检出限为0.009～0.010 μg·mL-1（表1）。
表1 10种农药的线性回归方程、线性范围、检出限和定量限Table 1 Linear regression equation, linear range, limit of detection and limit of quantification of 10 pesticides
2.4 添加回收率和精密度
对‘无核白’葡萄样品分别加入3种不同浓度（0.02、0.05、0.15 μg·mL-1）的标准溶液，按照1.3.3的前处理方法进行处理，每个水平重复5次，进行加标回收率试验。10种氨基甲酸酯类农药平均回收率为77%～104%，相对标准偏差（RSD）在1.1%～6.5%（表2），说明该方法可靠，重现性较好。
表2 十种农药的回收率和相对标准偏差Table 2 Recovery and relative standard deviation of 10 pesticides（n＝5）
2.5 实际样品检测
抽取‘无核白’‘马奶子’‘博尔特’‘绿香妃’‘红香妃’5种新疆常见市售葡萄样品合计20批次，采用1.3.3的前处理方法进行检测，共检出两批次样本中含有氨基甲酸酯类农药。其中1批次‘无核白’葡萄检出克百威（0.00962 mg·kg-1），1批次‘博尔特’中检出灭多威（0.0701 mg·kg-1），含量均符合食品安全国家标准的有关限量规定。说明该方法能够在不同葡萄品种中检出目标组分，具有一定的普遍适用性。
本文通过优化前处理方法以及液相色谱条件，建立了基于高效液相色谱法快速测定葡萄中10种氨基甲酸酯类农药残留的方法，并对该方法进行了充分的方法学验证，最后又成功将该方法应用于多种葡萄样本的实际测定过程。该方法相较国标方法，减少了乙腈等有机试剂的用量，避开了二氯甲烷等危险化学品的使用，简化了前处理步骤，回收率好，极大地提高了检测效率。查阅相关文献资料发现，在学术领域该方法同样具有先进性。与何家国等[20]采用的高效液相色谱-柱后衍生荧光法同时检测粮食中8种氨基甲酸酯类农药方法相比，本方法在前处理中省去了通过SPE小柱进行净化的步骤，从而节约了大量前处理时间。
综上所述，该方法具有操作简便、加标回收率高、检测效率高以及结果准确性强等优点，能够充分满足葡萄农产品质量安全监测量大、高频的检测需求，为有效控制葡萄质量安全提供了可靠的技术保障。
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