阿丽米热·伊力哈木，卡米力江·买买提明，美尔瓦提，李朝阳
（新疆维吾尔自治区人民医院 1.整形外科；
2.颌面外科；
3.临床心理科 新疆 乌鲁木齐 830001）
深部烧伤、严重外伤或感染后皮肤的异常修复均可导致组织内成纤维细胞（Fibroblasts，FB）过度增殖以及增生性瘢痕（Hypertrophic scars，HS）的形成[1-2]。HS会导致严重的畸形及其他不良反应，给患者精神上造成巨大痛苦。尽管目前瘢痕治疗方法较多，但均很难获得理想效果[3]。脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是一种从脂肪组织中分离出来的重要干细胞类型，具有易获取、多向分化、增殖潜力高和自我更新等特性[4]。外泌体（Exosome，Exo）是径粒大小40～100 nm的细胞外小囊泡，可调节细胞生物学行为，充当细胞间通讯工具[5]。ADSCs来源Exo是ADSCs旁分泌释放的重要成分，具有多种生物学活性。组织再生需要多种生长因子、蛋白酶、祖细胞和产生炎性细胞因子的免疫细胞所组成的协调“网络”，作为细胞间的信使，ADSCs来源Exo能够通过调控成纤维细胞的迁移和增殖、促进新生血管形成以及不同组织中的其他特定功能，从而在组织创伤修复中发挥积极作用[5-6]。microRNA（miRNA）作为特定信使RNA的重要转录后调节因子，参与调节细胞增殖、分化和凋亡。目前，关于miRNA与增生性瘢痕发生发展的关系研究越来越多。研究表明，miR-145在ADSCs来源Exo中过表达能影响细胞的生物学行为进而发挥相关作用，例如促进软骨形成、抑制炎症反应[7]，而其在ADSCs来源Exo对人增生性瘢痕成纤维细胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HSF）增殖与凋亡中的功能尚未见报道。鉴于此，本研究以HSF细胞作为研究对象，将过表达miR-145的ADSCs来源Exo与HSF细胞共培养，探究这一体系下HSF细胞增殖与凋亡的变化及具体分子机制，以期为增生性瘢痕的临床治疗研究提供新依据与新方案。
1.1 材料
1.1.1 临床样本：增生性瘢痕组织取自医院整形外科，为烧伤或术后6个月以上的瘢痕患者的瘢痕组织标本。其中男3例，女1例，年龄22～41岁，平均年龄为（27±8）岁。脂肪组织取自医院进行吸脂术的患者，女3例，年龄25～35岁，平均年龄为（27±5）岁。实验前所有患者均被告知了研究目的，获得同意并签署了手术知情同意书。
1.1.2 主要试剂：Ⅰ型胶原酶、青霉素、链霉素和DMEM培养基购于美国GIBCO公司，胎牛血清购于杭州四季青生物公司，Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司，miRNA反转录试剂盒和荧光实时定量PCR试剂盒购于大连海基生物科技公司，通用型外泌体提取试剂盒购于江苏凯基生物有限公司，PKH67细胞膜染色试剂盒购于北京百奥莱博生物公司，EdU细胞增殖检测试剂盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于上海贝博生物公司，RIPA裂解液、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒和ECL发光液购于上海碧云天生物研究所，GAPDH、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、CD63、CD81、CD9和TSG101抗体均购于英国Abcam公司，含miR-145过表达慢病毒载体和阴性对照miR-NC慢病毒载体的构建、包装均有上海生工生物工程有限公司完成，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞分离与培养
1.2.1.1 HSF细胞分离与培养：将增生性瘢痕组织剪成大小约1 cm3的组织块，添加0.1 mg/mlⅠ型胶原酶溶液，37℃下培养3 h，滤过，以300×g离心5 min，添加含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，3～4 d换液1次，待细胞汇集率达到80%以上时，0.25%胰酶消化，取传代3～5代后的HSF细胞进行后续研究。
1.2.1.2 ADSCs分离与培养：在脂肪组织中添加0.1 mg/mlⅠ型胶原酶溶液，消化后，以300×g离心5 min，弃去上清液，添加含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，3～4 d换液1次，待细胞汇集率达到80%以上时，0.25%胰酶消化并传代培养，倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞，PBS重悬，调整细胞密度为1×106个/毫升，取100μl细胞悬液，分别加入CD44、CD90及CD105单抗，室温避光条件下孵育30 min，PBS洗涤并重悬，通过流式细胞仪检测细胞各表面标志物表达情况。
1.2.2 脂肪干细胞转染：调整对数生长期ADSCs的密度，按照1×105个/孔的密度接种于6孔板内，置于37℃、5% CO2培养箱中过夜培养。分别将含miR-145过表达的慢病毒和对应阴性对照miR-NC的慢病毒添加至细胞培养板内以感染ADSCs，病毒感染比率值为50:1，两组细胞分别记为miR-145-ADSCs组和miR-NC-ADSCs组，并以正常培养的ADSCs作为对照，记为ADSCs组。置于37℃、5% CO2培养箱中培养4 h后，弃原液，添加新鲜培养液培养，72 h后以1 mg/L嘌呤霉素进行筛选，获得稳定过表达miR-145的细胞株。
1.2.3 实时荧光定量PCR：收集转染后获得的ADSCs，Trizol法提取各组细胞总RNA，参照miRNA反转录试剂盒说明，将总RNA逆转录合成cDNA，以获得的cDNA为模版，设计miR-145和内参基因U6的上、下游引物序列，具体如下：miR-145上游引物：5’-GTCCAGTTTTCCCAGG-3’，下游引物：5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’；
U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用荧光实时定量PCR系统检测miR-145表达水平，具体参照试剂盒说明书执行，扩增程序设置为：95℃ 3 min，循环1次；
95℃ 12 s、62℃40 s、95℃ 15 s，循环45次，实验重复3次。扩增结束后，根据2-△△Ct法计算miR-145相对表达量。
1.2.4 外泌体提取与鉴定：收集转染后48 h各处理组ADSCs上清液，采用密度梯度离心法分离ADSCs来源的Exo。在4℃下以300×g离心10 min，保留上清，3 000×g离心15 min，保留上清，10 000×g离心30 min，保留上清，0.22 μm滤膜过滤，添加外泌体提取试剂液A，混均匀，4℃下静置12 h，再在4℃下以10 000×g离心60 min，弃上清，留沉淀，在沉淀中加入保存液试剂B，轻轻吹打混匀，将样品保存于-80℃备用。采用透射电镜观察颗粒物的形态，纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布，Western blot检测Exo表面标志性蛋白CD63、CD81、CD9和TSG101的表达情况。
1.2.5 Western blot检测：取制备的ADSCs来源Exo或各组ADSCs，添加RIPA裂解液进行裂解，提取总蛋白并定量。通过10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜、封闭，加入一抗（1:1 000），4℃与膜共孵育过夜；
次日，TBST洗膜，加入对应二抗（1:5 000），室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL显色，凝胶成像系统拍摄蛋白条带，并通过Image J软件测定各蛋白表达水平。
1.2.6 外泌体与成纤维细胞共培养：调整对数生长期HSF细胞的密度，按照1×105个/孔接种于96孔板中，实验具体分组与处理如下：对照组，正常培养的HSF细胞；
Exo组，使用含10μg/ml ADSCs来源Exo的培养基培养HSF细胞；
miRNC-Exo组，使用含10μg/ml转染miR-NC的ADSCs来源Exo的培养基培养HSF细胞；
miR-145-Exo组，使用含10μg/ml转染miR-145的ADSCs来源Exo的培养基培养HSF细胞。按照分组建立细胞培养体系后，将各处理组细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h，结束后收集细胞，进行后续实验研究。
1.2.7 免疫荧光染色：取制备的ADSCs来源Exo，重悬于PBS溶液中，加入PKH67染料并混匀，4℃下避光染色20 min，以10 000×g离心30 min，弃上清，洗去多余染料，重悬于PBS溶液中备用。将HSF细胞置于37℃、5% CO2培养箱中过夜培养，待细胞贴壁后添加PKH67荧光标记的ADSCs来源Exo，孵育12 h后，PBS洗涤，DAPI染核10 min，洗涤、封片、干燥，通过荧光共聚焦显微镜观察PKH67荧光标记的ADSCs来源Exo被HSF细胞摄取情况。
1.2.8 EdU染色：收集1.2.6处理后的各组HSF细胞，调整细胞密度按照1×105个/孔接种于24孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱内过夜培养。添加10μmol/L EdU进行染色处理，PBS洗涤后，滴加Apollo567避光孵育30 min，DAPI染核，洗涤后封片，通过激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况，摄取图片，红色代表EdU+阳性细胞胞核。
1.2.9 流式细胞术：收集1.2.6处理后的各组HSF细胞，0.25%胰酶消化，加入1×Binding Buffer制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×106/ml，吸取100μl移入流式管，分别依次加入5μl FITC-Annexin Ⅴ与5μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，离心后加入400μl 1×Binding Buffer重悬，立即通过流式细胞仪上机检测各组细胞的凋亡情况。
2.1 ADSCs形态观察与鉴定：通过倒置显微镜观察可见，原代ADSCs培养至第3天时细胞贴壁生长，呈纤维细胞样，束状；
培养至第7天，细胞为均一长梭形，增殖速度较快，密集生长，呈旋涡状排列，见图1A～B。采用流式细胞技术检测第3代ADSCs的表面标志物CD44、CD90及CD105表达，结果显示，CD44、CD90及CD105的表达率分别为99.1%、97.9%、90.9%，均为阳性表达，见图1B。由此说明成功分离到ADSCs细胞。
图1 ADSCs形态与鉴定
2.2 ADSCs转染效率检测：实时荧光定量PCR检测结果显示，miR-145-ADSCs组细胞中miR-145相对表达量显著高于ADSCs组和miR-NC-ADSCs组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。
图2 实时荧光定量PCR检测各组ADSCs中miR-145表达
2.3 过表达miR-145的ADSCs来源外泌体鉴定：在透射电镜下观察分离颗粒物，可见其呈杯状或球状，为囊泡，测量到粒径峰值约分布在100 nm处，见图3A～B。经Western blot检测发现，外泌体标志蛋白CD63、CD81、CD9和TSG101均呈阳性表达，见图3C。由此说明分离的颗粒物为外泌体。
图3 ADSCs来源外泌体的鉴定
2.4 过表达miR-145的ADSCs来源外泌体被HSF细胞摄取情况：将ADSCs来源外泌体与HSF细胞共培养后，通过荧光显微镜可见HSF细胞周围有绿色荧光标记的外泌体表达，且PKH67标记的外泌体分布于HSF细胞核周围，说明该外泌体可被HSF细胞所摄取，见图4。
图4 荧光显微镜观察外泌体被HSF细胞的摄取情况（100×）
2.5 过表达miR-145的ADSCs来源外泌体对HSF细胞增殖的影响：通过EdU染色HSF细胞增殖情况，结果显示，与对照组比较，Exo组HSF细胞内红色荧光染色细胞数目明显减少，EdU+阳性细胞百分率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与Exo组比较，miR-145-Exo组HSF细胞内红色荧光染色细胞数目进一步减少，EdU+阳性细胞百分率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
而miR-NC-Exo组与Exo组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图5～6。
图5 EdU染色检测各组HSF细胞增殖情况（100×）
图6 各组EdU+阳性细胞情况
2.6 过表达miR-145的ADSCs来源外泌体对HSF细胞凋亡的影响：流式细胞术检测HSF细胞凋亡水平，结果显示，Exo组HSF细胞凋亡率显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；
而相较于Exo组，miR-145-Exo组的细胞凋亡率显著增加差异有统计学意义（P＜0.05）；
miR-NCExo组与Exo组比较差异则无统计学意义（P＞0.05），见图7～8。
图7 流式细胞术检测各组HSF细胞凋亡率
图8 各组HSF细胞凋亡情况
Western blot检测HSF细胞内凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2以及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达水平，检测结果显示，与对照组比较，Exo组细胞内cleavedcaspase-3和Bax的蛋白相对表达量显著上调，Bcl-2、COL-Ⅰ及COL-Ⅲ蛋白相对表达量显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与Exo组比较，miR-145-Exo组细胞内cleaved-caspase-3和Bax的蛋白相对表达量显著上调，同时，Bcl-2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白相对表达量均显著下调差异有统计学意义（P＜0.05）。见图9～10。
图9 Western blot检测HSF细胞内凋亡相关蛋白及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达
图10 Western blot检测HSF细胞内凋亡相关蛋白及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达
HS本质上是一种纤维增生性疾病，其外部特征是凸起、红色、结节、无弹性的瘢痕形成，与正常瘢痕相比，其消退缓慢且不完全自愈。目前，主要采用非手术方法和手术切除进行治疗，非手术方法主要包括局部压缩、有机硅膜粘附、激光疗法、冷冻疗法、皮质类固醇局部注射和放疗，然而，这些方法均有一定的局限性或副作用，可能涉及较长的治疗周期与严重并发症，甚至诱发肿瘤；
此外，手术切除经常会导致复发、功能障碍和外观恶化等，可见，以上方法均不能达到满意的治疗效果[3,8]。因此，探究新型有效的方法来预防和治疗瘢痕增生已成为皮肤科和整形外科领域的一项重要研究内容。
ADSCs来源Exo参与协调组织再生、免疫功能、组织稳态和细胞行为等过程。Exo携带亲代ADSCs的特定内容，包括DNA、RNA、脂质、细胞因子以及酶，Exo能够保护其运输的物质免于降解，并且在血液中高度稳定，从而有效地将分子物质运送到靶细胞，现已用于靶向药物递送和作为再生医学的基因载体[9]。研究表明，ADSCs来源Exo阻止了成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，增加TGF-β3与TGF-β1的比率。此外，ADSCs来源Exo通过激活ERK/MAPK通路增加皮肤真皮成纤维细胞内MMP3表达，促进细胞外基质的重塑，从而促进伤口愈合并减少瘢痕形成[10]。本研究通过在体外采用ADSCs来源Exo处理增生性瘢痕中的HSF细胞后，经检测发现，细胞增殖活性下降，促进了细胞的凋亡，并上调了促凋亡蛋白cleaved-caspase-3和Bax的表达，抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。本研究结果进一步证明了ADSCs来源Exo可能具有抑制或减少增生性瘢痕形成的作用。
miRNA与靶基因的相互作用是复杂的，其可直接结合到目标mRNA的3"UTR区域来负调控目标基因的表达，从而发挥相应的功能作用[11]。越来越多的证据表明，miRNA参与了HS的生长与发展过程，其表达与HSF细胞的细胞外基质产生、增殖、分化和凋亡有关。例如，Zhang等[12]研究报道指出miR-130a可以通过靶向CYLD促进Akt活化，从而诱导HS中的成纤维细胞增殖；
Zhou等[13]研究证实miR-519d通过抑制HS中成纤维细胞的增殖并促进细胞凋亡，从而发挥抑制瘢痕形成的作用。现已知miR-145与肿瘤发生、心肌损伤和血管生成密切相关[14-16]，还有研究揭示了miR-145与HS的发生发展有关，Zhu等[17]报道指出过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂通过上调miR-145的表达，抑制了TGF-β/SMAD3信号通路的激活，从而抑制HS形成；
Wang等[18]研究表明miR-145在肥厚性瘢痕组织中表达降低，并与SOX-9表达呈负相关，还说明了miR-145通过下调SOX-9的表达来抑制成纤维细胞的增殖和侵袭，并促进成纤维细胞凋亡。本研究结果显示，miR-145过表达ADSCs来源的Exo能够进一步抑制HSF细胞增殖，并促进细胞凋亡，这从miRNA水平阐述了ADSCs来源外泌体对HSF细胞的作用。
HS发生发展与众多纤维化相关基因密切相关，先前已有研究揭示了瘢痕组织形成与胶原代谢失衡之间的相关性，并发现增生性瘢痕来源的HSF细胞比正常成纤维细胞具有更大的增殖能力与合成细胞外基质的能力[19]。Exo在伤口愈合早期阶段通过合成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原促进胶原蛋白重塑，而在晚期阶段则通过抑制胶原蛋白的合成而减少瘢痕形成。而在HS形成过程中，胶原蛋白的表达上调意味着细胞外基质的积累，从而促进了HSF细胞的原纤维形成[20]。在本研究中，利用miR-145过表达ADSCs来源的Exo处理HSF细胞后，经检测发现细胞内COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白表达水平均下调，说明胶原合成受到抑制，该作用有利于减少HS的形成。
综上所述，本研究表明ADSCs来源的Exo能够有效传递miR-145来抑制HS内HSF细胞增殖，并促进细胞凋亡，通过进一步下调COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表达抑制HSF细胞内胶原合成，从而减少瘢痕的生成，这对于临床上开发HS新的治疗方案提供了实验证据。但关于miR-145调控HSF细胞的具体分子机制及其在体内是否也能够发挥有效作用，有待后续进行相关实验探究。
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