李睿琦 张新星 高志岭 廖文华 刘春敬
(河北农业大学资源与环境科学学院,河北省农田生态环境重点实验室,河北 保定 071000)
反硝化作用是推动自然界中氮素循环的重要环节,既可用于治理水体污染[1],减少环境中的硝酸盐累积,又可能造成农田氮肥的流失[2]。反硝化作用产生的N2O是一种重要的温室气体,对臭氧层有破坏作用[3-4],其作用机制及所涉及酶和微生物的研究越来越引起广泛重视。随着对根系分泌物-微生物-土壤氮循环研究的深入了解,发现某些植物根系分泌物或代谢产物具有抑制土壤硝化及反硝化过程的作用[5-6]。基于此,研究者将从自然界中植物根系分泌的或从植物组织中提取的对硝化或反硝化作用有特定抑制效果的化合物命名为“生物硝化抑制剂(BNI)”和“生物反硝化抑制剂(BDI)”。
生物抑制剂的研究起初大多集中在土壤硝化过程方面[7-9],少数早期研究者虽然提出一些植物具有较低的反硝化能力[10],通常认为是非生物因素导致这种结果[11]。近年来,随着一些学者对原产于东亚的入侵植物Fallopiaspp.的进一步研究,本应非常适合在低肥力土壤中生长的植物,并能大幅度提高土壤肥力、增加氮累积量的富集植物[12-15],其入侵土壤的反硝化潜势却出现降低的趋势,但影响反硝化的非生物因素却没有发生变化[16]。研究人员从Fallopiaspp.根系提取物中发现B型原花青素(PC)可以通过诱导酶的构象变化,特异性地抑制与膜结合的硝酸还原酶活性,并首次提出了BDI的概念[17-21]。PC的应用虽然可以提高氮素利用率、降低环境效应,但由于其价格较高,并不适用于农业生产。
苯甲酸广泛存在于植物组织及其根际分泌物中,研究发现牧场中牛的尿斑成分会影响温室气体N2O的排放,3.9 mmol/L的马尿酸可明显抑制土壤N2O的排放,并推测其原因是水解产物苯甲酸对反硝化过程的抑制导致的[22-24],但尚未得到证实。因此,本研究通过选取来源于土壤中性能不同的反硝化细菌为研究对象,探索土壤反硝化细菌对苯甲酸浓度变化的响应,为深入理解植物与土壤微生物交互作用提供理论指导。
1.1 试验材料
供试菌种：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC13985),脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)(ATCC19367)。
供试药品：苯甲酸(纯度99.5%)。
LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化钠10 g/L。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入15 g/L琼脂粉。
DM培养基：硝酸钾0.72 g/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,七水合硫酸镁0.2 g/L,六水合丁二酸钠2.8 g/L,pH=7.0。
1.2 试验设计
1.2.1 不同浓度苯甲酸对反硝化细菌氮素转化的影响
(1) 设置4个苯甲酸摩尔浓度,分别为1、2、3、4 mmol/L,以不加苯甲酸为空白对照,编号分别为B1、B2、B3、B4、CK,所有处理重复3次。
(2) 菌株的培养：试验选取了土壤中常见的两种不同属的反硝化细菌：脱氮副球菌和缺乏N2O还原酶活性的反硝化细菌——铜绿假单胞菌。试验期间,首先对两种细菌进行活化,将2 mL含有20%(体积分数)甘油的铜绿假单胞菌和脱氮副球菌菌液接种至25 mL LB液体培养基中,在摇床上(30 ℃、160 r/min)培养24 h,在其对数生长期时转接至LB固体培养基上,30 ℃恒温培养24 h;在对数生长期时挑取单菌落接种至100 mL LB液体培养基中,恒温振荡24 h,将100 mL菌液离心后(3 500 r/min,10 min),将菌体用0.9%(体积分数)的生理盐水冲洗3次,重新悬浮于200 mL 0.9%的生理盐水中,放入摇床培养2 h后,将菌液离心(3 500 r/min,10 min),悬浮于DM培养基中,并调整培养液在波长600 nm处的吸光值(OD600)等于0.2待用。
1.2.2 单一碳源苯甲酸对反硝化细菌的影响
(1) 设置4个苯甲酸摩尔浓度,分别为1、2、3、4 mmol/L。
(2) 菌株的培养：同1.2.1中的步骤,其中将DM培养基中的碳源六水合丁二酸钠去除。
(3) 将不同浓度的苯甲酸与菌液等体积加入厌氧瓶中,每隔12 h抽取2 mL气体样品用于N2O含量的测定。测定72 h后的菌液中苯甲酸的含量。
1.3 测定方法及计算
采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010软件进行作图和统计分析,采用单因素方差分析(LSD)、邓肯多重比较对试验数据进行分析。
2.1 单一碳源苯甲酸对反硝化细菌的影响
为了验证铜绿假单胞菌和脱氮副球菌是否具有转化和利用苯甲酸作为碳源的能力,设置了用苯甲酸作为单一碳源的试验,结果见图1。由图1可见,与初始时刻菌液中苯甲酸浓度相比,72 h时两个反硝化细菌的菌液中苯甲酸含量均无显著变化,两种细菌均没有分解苯甲酸。试验过程中OD600无显著提高,72 h内无N2O明显排放,表明苯甲酸不能被两种细菌所分解,即在后续细菌培养试验中苯甲酸不会作为碳源被细菌利用。
2.2 不同浓度苯甲酸对反硝化细菌OD600的影响
如图2(a)所示,CK、B1、B2、B3处理的铜绿假单胞菌OD600在6 h之后开始不同程度的增长,其中CK处理的铜绿假单胞菌数量增长得最为迅速,在18 h时已经到达峰值;B1处理下的铜绿假单胞菌在试验期间一直处于上升趋势,在72 h时到达峰值,且与CK处理的峰值相比差异不显著;B2、B3处理下铜绿假单胞菌的OD600增长缓慢,在72 h到达峰值,而B4处理下的铜绿假单胞菌OD600无明显增长。
如图2(b)所示,CK、B1、B2处理的脱氮副球菌OD600在前18 h内迅速增长,之后趋于平稳,分别达到最大值为0.326、0.329、0.300,B1、B2处理的OD600最大值与CK相比并无显著差异,表明1、2 mmol/L的苯甲酸对脱氮副球菌生长并无明显抑制效果,仅在前18 h抑制其生长速率;B3处理的OD600在30 h时开始上升,42 h时到达峰值0.208,在试验结束时OD600降至0.147,显著低于CK;B4处理的OD600一直保持初始值,并无明显变化,说明高浓度的苯甲酸可有效抑制脱氮副球菌的生长,且浓度越高抑制效果越好。
2.3 不同浓度苯甲酸对反硝化细菌氮素转化的影响
2.3.1 N2O动态变化
如图3(a)所示,CK、B1、B2、B3处理下的N2O质量浓度在前50 h均有不同程度上升,之后趋于稳定,于72 h时达到最高值,分别为2 259.27、3 667.47、2 901.53、1 588.06 mg/m3。B4处理在前50 h未检测到N2O的排放,在72 h时N2O质量浓度达到最高值仅为166.69 mg/m3。B1、B2与CK相比,两者均显著促进了反硝化过程中N2O的排放,72 h时N2O累积排放质量浓度较CK分别增加了62.3%、28.4%;与之相反,B3、B4则均显著抑制了反硝化过程中N2O的排放,72 h内N2O累积排放质量浓度较CK分别降低了29.7%、92.6%,其中B4几乎完全抑制了铜绿假单胞菌的反硝化过程。由此可知,苯甲酸对铜绿假单胞菌反硝化作用表现出低浓度促进、高浓度抑制N2O产生的特征。
如图3(b)所示,CK处理下的N2O质量浓度在前42 h内一直呈上升趋势,之后趋于稳定。B1、B2处理下的N2O质量浓度在72 h内亦呈上升趋势,但显著低于CK处理,B3、B4处理则未检测到显著的N2O排放。由此可知,苯甲酸可显著抑制脱氮副球菌反硝化作用产生的N2O排放,且影响强度随着浓度增加而逐渐增强。
图1 72 h菌液中苯甲酸摩尔浓度Fig.1 The molar concentration of benzoic acid in the bacteria liquid at 72 h
图2 不同浓度苯甲酸对细菌OD600的影响Fig.2 Effects of different concentrations of benzoic acid on bacteria OD600
图4 不同浓度苯甲酸对的影响Fig.4 Effects of different concentrations of benzoic acid on
图5 不同浓度苯甲酸对的影响Fig.5 Effects of different concentrations of benzoic acid on
2.4 不同浓度苯甲酸下反硝化细菌pH的动态变化
由图6可知,铜绿假单胞菌和脱氮副球菌菌液的初始pH均随着苯甲酸浓度的升高而逐渐降低,从6.5左右下降至5.5左右。由图6(a)还可以发现,尽管不同处理的铜绿假单胞菌菌液pH均随着时间逐渐升高,但B2、B3和B4处理的pH远低于CK和B1处理,尤其是B4处理的pH在试验期间变化甚微,始终保持在5.5左右。根据图6(b),B1、B2处理的pH与CK的动态特征基本一致,而B3和B4处理的pH远低于上述3个处理。由此可知,添加苯甲酸引起的菌液pH的变化可能也是影响反硝化过程的因素之一。
2.5 不同浓度苯甲酸对反硝化细菌关键酶活性的影响
本研究测定了72 h时不同处理的NR和NiR,以进一步分析添加苯甲酸对两种菌液反硝化过程的影响。由图7可知,铜绿假单胞菌菌液CK的NR要显著高于脱氮副球菌菌液CK,其NiR活性也显著低于脱氮副球菌菌液,表明前者的反硝化效率可能要高于后者。
图6 不同浓度苯甲酸对菌液pH的影响Fig.6 Effect of different concentration benzoic acid on pH of bacterial solution
注：不同小写字母间表示差异显著,相同小写字母间表示差异不显著。图7 72 h时不同浓度苯甲酸对细菌NR、NiR的影响Fig.7 Effects of different concentrations of benzoic acid on bacterial NR and NiR at 72 h
研究表明,土壤中能降解苯甲酸的反硝化微生物种类较多[26],外源可溶性碳的添加可能间接增强土壤微生物反硝化作用,从而促进土壤N2O排放[27-30],而本试验证实选取的两种反硝化细菌在厌氧条件下均不能分解苯甲酸,因此在试验中苯甲酸不会作为碳源来干扰细菌的反硝化过程。
本研究中,铜绿假单胞菌和脱氮副球菌的OD600均随着苯甲酸的增加、菌液pH下降而下降。这与前人研究结果一致,即苯甲酸抑菌效果与pH密切相关,这是由于苯甲酸的抑菌作用主要是以酸化细胞体内储碱的方式使细胞的呼吸酶系失去活性[31-32]。
综上,铜绿假单胞菌和脱氮副球菌反硝化过程不仅对苯甲酸添加量的响应存在明显差异,且其主要受制环节上也存在一定程度的不同,因此还需要开展更多的研究,进一步探讨苯甲酸对其他类型反硝化细菌的氮转化过程的影响,摸索其抑制反硝化过程的主要条件,为苯甲酸的田间应用提供理论指导。
(1) 不同苯甲酸浓度均可抑制脱氮副球菌的N2O生成,但仅高浓度苯甲酸抑制了铜绿假单胞菌的N2O生成。
(2) 苯甲酸对铜绿假单胞菌的生长和反硝化过程影响具有低浓度促进、高浓度抑制的特征,而对脱氮副球菌的生长和反硝化过程均为抑制作用。