王圣心，王力，张建国，许琪，寻立之，李晓华*
（1中南民族大学 生命科学学院&微生物资源与利用湖北省工程技术研究中心，武汉 430074；
2江苏神力生态农业科技有限公司，宜兴 214221）
淀粉酶是催化淀粉水解酶的总称，按水解淀粉方式可以将淀粉酶分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4类.淀粉酶广泛的应用于工业、农业、畜牧业中［1-2］，其中用于淀粉转化领域的酶制剂销量占全世界酶制剂销售总量的10%～15%［3-4］.饲料中添加淀粉酶可以提高饲料利用率，促进动物生长，减少粪便等污物的排放，改善养殖环境，提高动物机体免疫［5-7］.1894年，从真菌中鉴定和分离出淀粉酶，由于淀粉酶具有广泛用途，引起了广泛关注［8］，目前，已报道的能够产生淀粉酶的微生物主要有：不动杆菌属（Acinetobacter）、微球菌属（Micrococcus）、黄隐球酵母（Cryptococcus flavus）、盐单 胞 菌（Halomonas meridiana）、青 霉 菌 属（Penicillum）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、假单胞菌属（Pseudoalteromonas）、杆菌属（Bacillus）等［9-11］.α-淀粉酶产生菌大部分来源于自然界中，因此从自然界中分离获得新的α-淀粉酶产生菌具有重要意义.
本文从健康的牛胃秸秆发酵物中分离α-淀粉酶产生菌株，并通过菌落特征、生理生化性质、16SrDNA序列对比分析对菌株进行鉴定，进一步对菌株产酶条件进行研究，为α-淀粉酶在秸秆饲料中应用奠定基础.
1.1 材料
样品采集于湖南省长沙县养殖场健康牛胃秸秆发酵物.
1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，琼脂18.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.0.基础发酵培养基：葡萄糖5.0 g，酵母浸粉10.0 g，H2O 1000.0 mL，pH自然.淀粉培养基：可溶性淀粉10.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.0～7.2.
1.3 实验方法
1.3.1 产α-淀粉酶菌株的筛选
将牛胃秸秆发酵物在淀粉液体培养基中37℃，180 r·min-1，富集培养24 h，取富集培养液1 mL，稀释涂布于淀粉固体培养基中，37℃培养24 h，多次分离纯化挑取单菌落［12-13］.用牛津杯法［14］测定淀粉降解圈大小，重复3次.
1.3.2 菌落特征、生理生化特性和16SrDNA序列的扩增
将筛选得到的菌株划线接种后，37℃培养12 h，在显微镜下观察菌落的特征.根据《常见细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化鉴定［14-15］.提取菌株基因组DNA［16］，使用16SrDNA通用引物［17］扩增.引物为：16SrDNA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；
16S rDNA-R：GGTTACCTTGTTACGACTT，PCR产物测序，利用BLAST对16SrDNA序列比对分析，使用MEGA7.0构建系统进化树.
1.3.3 菌株产酶条件优化
以培养时间、温度、pH、碳源、氮源、金属离子作为影响因素，依次改变其中一种因素，保持其他条件不变，研究各因素对产α-淀粉酶产量的影响.
以1%接种量将SCUEC8菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为37℃、180 r·min-1条件下培养48 h，每4 h测定一次菌体量和酶活性.将培养温度分别设置为25、30、37、42、50、55℃，180 r·min-1条件下培养12 h.pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0.在温度为37℃、180 r·min-1条件下培养12 h.每个处理设置3次重复，测定菌株的生长量和α-淀粉酶活性.
以发酵培养基为基础，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉作为唯一碳源，浓度为10 g·L-1.分别以酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸铵为唯一氮源，浓度为10 g·L-1.分别添加1 g·L-1的Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Mg2+金属离子.以上述同样的接种量在37℃、180 r·min-1条件下培养12 h，每个处理设置3次重复，测定菌株的α-淀粉酶活性.
按国际单位规定：在37℃、pH 7.0条件下，每分钟催化可溶性淀粉水解产生1μg麦芽糖所需要的酶量定义为1个α-淀粉酶酶活单位（1 U）.
2.1 产α-淀粉酶菌株的筛选
从牛胃秸秆发酵物中分离纯化得到11株具有α-淀粉酶活性菌株，α-淀粉酶降解活性测定结果如表1所示，淀粉降解圈直径为14.17～32.67 mm，A2菌株淀粉降解圈直径最小，为14.17 mm，A8菌株淀粉降解圈直径最大，为32.67 mm，将A8菌株命名为SCUEC8菌株.
表1 菌株淀粉降解圈大小Tab.1 Sizeof starch degradation circleof strain
2.2 α-淀粉酶产生菌SCUEC8菌株的鉴定
SCUEC8菌株菌落呈米白色，菌落扁平，近圆形，边缘不规则，易挑取，无色素产生.SCUEC8菌株革兰氏染色呈阳性.水解淀粉试验为阳性，甲基红试验为阴性.
提取菌株SCUEC8基因组DNA作为模板，用引物16SrDNA-R和16SrDNA-F扩增16SrDNA序列，PCR产物测序，利用BLAST对16SrDNA序列比对分析，使用MEGA7.0构建系统进化树.结果如图1所示.由图1可见：SCUEC8菌株与BacillussubtilisATCC 6051相似性达到99%.结合菌落特征和生理生化特性，初步鉴定菌株SCUEC8为枯草芽孢杆菌.
图1 基于16SrDNA的SCUEC8菌株系统进化树Fig.1 Phylogenetics tree based on 16SrDNA gene sequence of strain SCUEC8
2.3 培养时间对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和酶活性影响
以1%接种量将SCUEC8菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，每隔4 h取样测定600 nm处吸光值和α-淀粉酶活性，结果见图2.由图2可见：培养时间在0～16 h范围内，菌株生长量和酶活性随时间的增加而增加，OD600由0.01增加到4.64，酶活性由25.0 U·mL-1增加到273.67 U·mL-1；
培养时间在16～48 h范围内，菌株的生长量和酶活性随着时间的增长而趋于平稳，OD600由4.64下降到4.22，酶活性由273.67 U·mL-1下降到208.78 U·mL-1.结果表明：培养时间为16 h时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和酶活性较高.
图2 培养时间对菌株SCUEC8的生长和产酶活性的影响Fig.2 Effect of culturetimeon growth and enzyme production of SCUEC8 strain
2.4 不同pH值对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和酶活性影响
以1%接种量将SCUEC8菌株接种到不同初始pH值的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养12 h后测定SCUEC8菌株生长量和α-淀粉酶活性，结果见图3.由图3可见：pH值在2～6范围内，菌株的生长量和α-淀粉酶活性随pH值的增加而增加，OD600由0.19增加到4.64，酶活性由112.60 U·mL-1增加到294.35 U·mL-1；
pH值在6～10范围内，菌株生长量和酶活性随pH值的增加而逐渐降低，OD600由4.64降低到0.49，酶活性由273.67 U·mL-1下降到141.71 U·mL-1.pH为6.0时，SCUEC8菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）；
pH为2.0时，SCUEC8菌株产酶活性显著低于其他实验组（P＜0.05）.结果表明：pH值为6时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和酶活性较高.
图3 pH值对SCUEC8菌株生长及产酶活性的影响Fig.3 Effects of pH value on the growth and enzymeproduction of SCUEC8 strain
2.5 培养温度对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和酶活性影响
以1%接种量将SCUEC8菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，培养12 h后测定SCUEC8菌株在不同培养温度下菌株生长量和α-淀粉酶活性，结果见图4.由图4可见：培养温度在25～37℃范围内，菌株生长量和酶活性随培养温度的升高而增加，OD600由0.12增加到4.64，酶活性由75.20 U·mL-1增加到273.67 U·mL-1；
培养温度在37～55℃范围内，菌株生长量和酶活性随温度的升高而下降，OD600由4.64下降到1.31，酶活性由273.67 U·mL-1下降到121.56 U·mL.温度为37℃时，SCUEC8菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）；
温度为25℃时，SCUEC8菌株产酶活性显著低于其他实验组（P＜0.05）.结果表明：培养温度为37℃时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和酶活性较高.
图4 培养温度对菌株SCUEC8的生长及产酶活性的影响Fig.4 Effects of culture temperature on the growth and enzymeproduction of SCUEC8 strain
2.6 碳源及其浓度对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株酶活性影响
以1%接种量将SCUEC8菌株接种到不同碳源的基础发酵培养基中培养12 h，测定SCUEC8菌株酶活性，结果见图5.由图5可见：分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉作为唯一碳源，SCUEC8菌株α-淀粉酶活性分别为287.37、239.82、343.13、273.03、309.52、187.35 U·mL-1.麦芽糖为碳源时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高，显著高于其他5个实验组（P＜0.05）；
魔芋粉为碳源时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较低，显著低于其他5个实验组（P＜0.05）.结果表明：麦芽糖为碳源时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高.
图5 不同碳源对SCUEC8菌株产酶活性影响Fig.5 Effect of different carbon sources on enzyme activity of SCUEC8 strain
将发酵培养基中的麦芽糖设为不同浓度梯度：5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1，培养12 h，测定α-淀粉酶活性，结果见图6.由图6可见：麦芽糖浓度在5.0～20.0 g·L-1范围内，酶活性从292.51 U·mL-1增加到379.23 U·mL-1；
麦芽糖浓度在20.0～30.0 g·L-1范围内，酶活性从379.23 U·mL-1下降到335.82 U·mL-1.麦芽糖浓度为20.0 g·L-1时，SCUEC8菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）；
麦芽糖浓度为5.0 g·L-1时，SCUEC8菌株产酶活性显著低于其他实验组（P＜0.05）.结果表明：麦芽糖浓度为20.0 g·L-1时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高.
图6 不同浓度麦芽糖对SCUEC8菌株产酶活性影响Fig.6 Effects of different concentration maltose on enzymeactivity of SCUEC8 strain
2.7 氮源及其浓度对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株产酶活性影响
以1%接种量将SCUEC8菌株接种到不同氮源的基础发酵培养基中，培养12 h测定SCUEC8菌株α-淀粉酶活性，结果见图7.由图7可见：分别以酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸铵为唯一氮源，SCUEC8菌株α-淀粉酶活性分别为284.10、400.12、332.63、272.62、116.02、100.03 U·mL-1.当胰蛋白胨作为唯一氮源时，菌株产α-淀粉酶活性最高为400.12 U·mL-1.胰蛋白胨为氮源时，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高，显著高于其他5个实验组（P＜0.05）；
硫酸铵为氮源时，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较低，显著低于其他5个实验组（P＜0.05）.结果表明：胰蛋白胨为氮源时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高.
图7 不同氮源对SCUEC8菌株产酶活性影响Fig.7 Effectsof different nitrogen on enzymeactivity of SCUEC8 strain
将胰蛋白胨浓度设置成不同梯度：5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1，培养12 h，测定α-淀粉酶活性，结果见图8.由图8可见：胰蛋白胨的浓度在5.0～15.0 g·L-1范围内，酶活性由353.62 U·mL-1增加到418.61 U·mL-1；
胰蛋白胨的浓度在15.0～30.0 g·L-1范围内，酶活性由418.61 U·mL-1下降到323.73U·mL-1.胰蛋白胨浓度为15.0 g·L-1时，SCUEC8菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）；
胰蛋白胨浓度为30.0 g·L-1时，SCUEC8菌株产酶活性显著低于其他实验组（P＜0.05）.结果表明：胰蛋白胨浓度为15.0 g·L-1时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高.
图8 不同浓度胰蛋白胨对SCUEC8菌株产酶活性影响Fig.8 Effectsof different concentration tryptoneon enzymeactivity of SCUEC8 strain
2.8 金属离子及其浓度对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株产酶活性影响
以1%接种量将SCUEC8菌株接种到加入不同金属离子的基础发酵培养基中，培养12 h，测定SCUEC8菌株α-淀粉酶活性，结果见图9.由图9可见：分别添加1 g·L-1的Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Mg2+金属离子，SCUEC8菌株α-淀粉酶活性分别为349.28、306.03、457.30、272.41、260.12 U·mL-1.添加Mn2+，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高，显著高于其他4个实验组（P＜0.05）；
添加Mg2+，SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较低，除与Cu2+组无显著性差异以外，与其他3个实验组均有显著性差异（P＜0.05）.结果表明：添加Mn2+，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高.
图9 不同金属离子对SCUEC8菌株产酶活性影响Fig.9 Effectof differentmetal ionsonenzymeactivityof SCUEC8strain
将Mn2+浓度设置成不同梯度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1，培养12 h，测定α-淀粉酶活性，结果见图10.由图10可见：Mn2+浓度在0.5～1.0 g·L-1范围内，酶活性由372.44 U·mL-1增长到441.72 U·mL-1；
Mn2+浓度在1.0～3.0 g·L-1范围内，酶活性由441.72 U·mL-1下降到301.89 U·mL-1.Mn2+浓度为1.0 g·L-1时，SCUEC8菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）；
Mn2+浓度为3.0 g·L-1时，SCUEC8菌株产酶活性显著低于其他实验组（P＜0.05）.结果表明：Mn2+浓度为1.0 g·L-1时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株的α-淀粉酶活性较高.
图10 不同浓度Mn2+对SCUEC8菌株产酶活性影响Fig.10 Effectsof different concentration Mn2+on enzymeactivity of SCUEC8 strain
本文从健康牛胃秸秆发酵物中筛选出11株产α-淀粉酶的菌株，其中SCUEC8菌株α-淀粉酶活性较高，通过对SCUEC8菌株形态学观察和生理生化特性，结合16SrDNA序列对比分析，初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）.不同碳源、氮源、培养条件等因素对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株产酶的影响进行研究，在培养时间为16 h、pH为6.0、培养温度为37℃、碳源为20.0 g·L-1的麦芽糖、氮源为15.0 g·L-1的胰蛋白胨、金属离子为1.0 g·L-1的Mn2+时，枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和α-淀粉酶的活性较高，为枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株在秸秆饲料中应用奠定基础.
目前已报道的枯草芽孢杆菌HM-22［17］，优化后的α-淀粉酶活力为147.53 U·mL-1，低于SCUEC8菌株，优化后的产酶条件为：培养时间24 h、培养温度40℃，pH 6.0、碳源为淀粉、氮源为牛肉膏.AL-JOHANI［19］等从温泉中分离出一株产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，优化后的产酶条件为：温度为45℃，pH为8.5，碳源为淀粉，氮源与SCUEC8菌株相同为胰蛋白胨，α-淀粉酶活力为18 U·mL-1.KUBRAK［20］等分离出一株芽孢杆菌属BKL20菌株，在培养时间为9 h，pH为7.0时，α-淀粉酶活力为300 U·mL-1，低于SCUEC8菌株.虽然很多研究者从芽孢杆菌中分离出产α-淀粉酶菌株，但远远不能满足工业生产对产酶菌株需求和酶性质的要求，产α-淀粉酶菌种资源的筛选备受瞩目，期待具有高活性的产α-淀粉酶微生物被不断分离，其优良特性被进一步阐明，使其应用前景更加广阔.
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