蒋烈浩，许世莹，钱晨宏，谭 卓，周 政，郑国湾，葛明华,王佳峰
(1. 浙江省人民医院(杭州医学院附属人民医院)，浙江 杭州 310014；
2. 浙江省内分泌腺体疾病诊治研究重点实验室，浙江 杭州 310014；
3. 浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053；
4. 蚌埠医学院研究生院，安徽 蚌埠 233030)
涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)又称为唾液腺腺样囊性癌，是常见的头颈部恶性肿瘤之一，早期以无痛性肿块多见,具有生长缓慢、嗜神经侵袭性较强、易发生远处转移等特点[1]。SACC早期治疗以手术切除为主，伴有淋巴结转移和远处转移者预后较差，因此中晚期和复发患者以放化疗、靶向治疗配以中药调节免疫力的综合治疗为主。姜黄素是从姜黄中提取的一种多酚物质，其可以促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移[2-3]。目前姜黄素对SACC细胞的调控作用及相关机制仍未十分明确，因此本研究以人源涎腺腺样囊性癌高转移株SACC-LM细胞株为研究对象，初步观察了姜黄素对SACC细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，并从JAK-STAT3信号通路角度探讨了其相关作用机制，以期为姜黄素用于SACC的治疗提供新的方向和思路。
1.1细胞株和药物 人源涎腺腺样囊性癌高转移株SACC-LM(北京大学口腔医学院李盛林教授惠赠)；
姜黄素(中国Sigma-Aldrich公司，C1386)。
1.2试剂及仪器 胎牛血清(Fetal Bovine Serum/FBS，Sera&Pro公司，S601P-500)；
RPMI-1640 Medium (with Penicillin-Streptomycin)(Biochannel，BC-M-016-500ml)；
CCK-8试剂盒(中国碧云天生物技术研究所,C0037)；
RIPA蛋白裂解液(中国碧云天生物技术研究所,P0013B)；
PMSF (中国碧云天生物技术研究所,ST506)；
BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天生物技术研究所,P0010S)；
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5×，还原型，中国碧云天生物技术研究所，P0015L)；
一抗STAT3(英国Abcam公司，ab68153)，TIMP1(英国Abcam公司，ab211926)，SNAIL(英国Abcam公司，ab216347)，CyclinD1(英国Abcam公司，ab16663)，MMP-9(英国Abcam公司，ab76003)，MMP-2(英国Abcam公司，ab92536)，二抗羊抗兔IgG(英国Abcam公司，ab6721)，二抗羊抗鼠IgG(英国Abcam公司，ab6789)；
AURAGENE ECL化学发光检测试剂盒(中国长沙艾佳生物公司，P001WB)；
膜联蛋白 V/藻红蛋白(Annexin V-PE)细胞凋亡检测试剂盒(中国碧云天生物技术研究所，批号 C1065S)；
蛋白电泳分子量300marker(美国Thermo公司，26634)、170marker(美国Thermo公司，26616)；
Thermo scientific protein ladders(美国Thermo公司，26617)；
流式细胞仪(美国安捷伦，Agilent Technologies)；
凝胶成像系统(美国伯乐，Bio-Rad)。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养 用RPMI-1640+10%FBS+10%胎牛血清+1%双抗培养SACC-LM细胞株，置于37 ℃恒温恒湿、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞融合率达到约90%时进行传代培养，以1∶2的比例进行传代。
1.3.2细胞增殖活性检测 将对数生长期的SACC-LM细胞接种于96孔板中，每孔3 000个细胞，在接种12 h细胞贴壁生长后，将细胞暴露于含姜黄素浓度分别为0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的培养基中，每个样本浓度6个复孔。处理72 h后，吸除原培养基，细胞中加100 μL含10%CCK-8的RPMI-1640培养基，培养箱静置2 h。利用紫外分光光度计于450 nm处检测细胞吸光度，计算细胞生长倍数。因为细胞生长在25 μmol/L浓度时发生了断崖式下跌，因此为了更加精确摸索姜黄素的适宜浓度，观察了姜黄素0μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L处理72 h后的细胞形态。同样方法检测SACC-LM细胞暴露于含姜黄素浓度分别为0 μmol/L、10 μmol/L的培养基中24 h、48 h、72 h、96 h的吸光度，计算细胞生长倍数，绘制生长曲线。
1.3.3细胞侵袭能力Transwell检测 实验分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素1μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组，各组分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h，用无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，制备细胞悬液，按50 个/μL浓度稀释，接种到铺有基质胶的Transwell小室内，每个小室加500 μL细胞悬液，下层的24孔板中加入750 μL含10%FBS的1640培养液，每组3个复孔，置于37 ℃培养箱中培养48 h；
然后用无菌棉签轻轻擦去Matrigel基质胶和上室未侵袭的细胞，用0.5%结晶紫对侵袭细胞染色，于显微镜下计数每组侵袭的细胞，并拍照。
1.3.4细胞迁移能力划痕实验检测 实验分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素1μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组，各组分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h后，将细胞以80万个/孔接种于6孔板，每组3个复孔。待细胞贴壁后用10 μL枪头垂直于培养板背面的直线做划痕处理，弃去培养基后，用PBS洗去被划下的细胞，记录划痕宽度，并加入无血清1640培养基继续培养，每隔12 h同一位置连续拍照记录各组细胞划痕宽度，计算单位长度内跨过划痕线的细胞数目。
1.3.5细胞凋亡流式细胞检测 实验分为姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组，各组分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h后,将细胞重悬于195 μL的Binding Buffer中，吹打混匀后再转移至5 mL的流式管中；
把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞1次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液，需避免胰酶的过度消化；
取细胞悬液，4 ℃下1 000 r/min离心5 min,弃上清；
加入1 mL预冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮,4 ℃下1 000 r/min离心5 min，弃上清；
加入200 μL的Binding Buffer悬浮细胞；
加入5 μL 7-AAD 混匀；
室温、避光、反应5 min；
加入1 μL Annexin V-PE染液，混匀；
室温、避光、反应15 min；
流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每个样品以流式细胞仪采集约10 000个细胞,右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为中晚期凋亡及死亡细胞。使用CXP分析软件进行分析。
1.3.6JAK-STAT3信号通路相关因子蛋白表达Western blot检测 实验分为姜黄素0 μmol/L组和姜黄素10 μmol/L组，分别用相应浓度的姜黄素培养液处理SACC-LM细胞72 h后,收集SACC-LM细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。将蛋白浓度调至一致后，每组每孔上样10 μg蛋白，用10%的SDS-PAGE将蛋白质分离，截取目的蛋白并转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h或4 ℃过夜，随后加入所需浓度的一抗于4 ℃孵育过夜。第2天洗去未结合一抗，加入二抗室温孵育1 h，洗去未结合二抗，滴加ECL显色液于暗室曝光显影。
2.1SACC-LM细胞存活率 培养72 h后，细胞存活率随姜黄素浓度的增高而降低，见图1；
10 μmol/L姜黄素处理时细胞增殖抑制比较合适，细胞形态完整，见图2；
0 μmol/L和10 μmol/L姜黄素处理细胞24 h、48 h、72 h、96 h的吸光度OD值逐渐增高，但10 μmol/L姜黄素处理各时间点吸光度OD值均更低(P均<0.05)，见图3。
图1 不同浓度姜黄素处理72 h后SACC-LM细胞增殖情况
图2 不同浓度姜黄素处理72 h后SACC-LM细胞形态(×200)
图3 0 μmol/L和10 μmol/L姜黄素处理不同时间SACC-LM细胞增殖情况
2.2SACC-LM细胞侵袭能力 姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组细胞侵袭率分别为(112.33±3.51)%、(93.00±4.36)%、(46.00±2.08)%、(21.66±3.05)%，姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组均明显低于姜黄素0 μmol/L组和姜黄素1 μmol/L组(P均<0.05)，且姜黄素10 μmol/L组明显低于姜黄素5 μmol/L组(P<0.05)。镜下观察各组细胞侵袭情况见图4。
图4 姜黄素各组SACC-LM细胞侵袭结晶紫染色情况(×200)
2.3SACC-LM细胞迁移转移能力 姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组细胞迁移率分别为(148.66±3.51)%、(138.66±3.05)%、(80.33±4.73)%、(30.66±5.51)%，姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组均明显低于姜黄素0 μmol/L组和姜黄素1 μmol/L组(P均<0.05)，且姜黄素10 μmol/L组明显低于姜黄素5 μmol/L组(P<0.05)。镜下观察各组细胞迁移情况见图5。
2.4SACC-LM细胞凋亡情况 姜黄素0 μmol/L组、姜黄素1 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组细胞凋亡率分别为(4.46±0.47)%、(6.41±0.43)%、(8.95±0.33)%、(15.07±0.50)%，姜黄素5 μmol/L组、姜黄素10 μmol/L组均明显高于姜黄素0 μmol/L组和姜黄素1 μmol/L组(P均<0.05)，且姜黄素10 μmol/L组明显高于姜黄素5 μmol/L组(P<0.05)。各组细胞凋亡流式细胞图见图6。
2.5SACC-LM细胞中JAK-STAT3信号通路相关蛋白表达情况 姜黄素10 μmol/L组SACC-LM细胞中STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表达量均明显低于姜黄素0μmol/L组(P均<0.05)。见图7。
图5 姜黄素各组SACC-LM细胞迁移情况(×200)
图6 姜黄素各组SACC-LM细胞凋亡流式细胞图
姜黄素的抗癌作用主要与其抗增殖和促凋亡作用有关，这已在人结肠癌细胞、人乳头状甲状腺癌细胞、慢性粒细胞白血病细胞系等体外研究中被证实[4-6]。体内研究也表明姜黄素可以阻止癌细胞扩散并抑制血管生成[7-8]。Bielak-Zmijewska等[9]观察到姜黄素诱导结肠癌细胞(HCT116系)和正常成纤维细胞凋亡的浓度分别为10 μmol/L和40 μmol/L。本研究用不同浓度的姜黄素处理SACC-LM细胞72 h，发现姜黄素可呈浓度依赖性抑制SACC-LM细胞的增殖，即随着姜黄素浓度的增高，抑制效果增强；
且姜黄素浓度为10 μmol/L时，细胞的增殖受到了明显抑制，但是细胞的形态保持完好，当姜黄素浓度为15 μmol/L时，SACC-LM细胞出现了断层似的死亡。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示姜黄素能呈浓度依赖性明显抑制SACC-LM细胞的侵袭和迁移，细胞凋亡检测显示姜黄素能呈浓度依赖性促进SACC-LM细胞凋亡。以上实验证实姜黄素能明显抑制SACC-LM细胞的增殖、侵袭和转移，促进SACC-LM细胞凋亡。
图7 2组SACC-LM细胞中JAK-STAT3信号通路相关蛋白表达情况
JAK-STAT信号通路是由酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK、信号转导和转录活化因子(STATs)组成的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡、转移等生物学过程[10-11]。STATs主要存在于胞浆中，其激活后可以转入细胞核内与DNA结合，可以转导细胞内的信号，调控转录过程。其中STAT3与肿瘤的关系最为密切，活化的STAT3蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与目的基因启动子区域结合，调控特定靶基因如CyclinD1、c-myc、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9、vemintin、VEGF等转录，这些转录产物分别在细胞增殖、细胞侵袭转移和血管生成中发挥关键作用[12]。目前已经发现JAK-STAT3信号通路在肝癌[13]、肺癌[14]、直肠癌[15]、乳腺癌[16]、胃癌[17]等多种恶性肿瘤中存在过度激活。Wang等[18]报道，JAK-STAT信号通路异常与腺样囊性癌的发生发展有密切联系，以JAK-STAT信号通路为靶点进行干预有望成为腺样囊性癌治疗的新途径。相关研究证实，姜黄素能够通过调控JAK-STAT信号传导通路，抑制宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC-7901细胞和肝癌Hep3细胞增殖[19-20]。在视网膜母细胞瘤中，给予姜黄素可增加miR-99a的表达，减少JAK1、STAT1和STAT3的表达，进而诱导凋亡细胞死亡并抑制细胞增殖、迁移[21]。Rajitha等[22]报道，姜黄素可通过抑制NF-κB途径，下调STAT3，从而预防血管新生来抑制肿瘤细胞增殖。本实验结果显示，10 μmol/L姜黄素处理SACC-LM细胞后，STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表达均明显下调，其中TIMP1、SNAIL、MMP-9、MMP-2是STAT3下游与细胞增殖、抗凋亡和转移相关的靶基因，受JAK-STAT3信号通路调控，故提示姜黄素可能通过调控JAK-STAT3信号通路来发挥抑制SACC-LM细胞增殖、侵袭和转移的作用。
综上所述，姜黄素可抑制SACC-LM细胞增殖、侵袭和转移，促进SACC-LM细胞凋亡，其作用机制可能与调控JAK-STAT3信号通路有关。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
猜你喜欢 素处理姜黄通路 毛壳素对绒山羊ADSCs组蛋白甲基化修饰的影响研究畜牧兽医学报(2022年7期)2022-08-05Traditional Chinese medicine Master XIONG Jibo’s medication experience in treating arthralgia syndrome through data miningDigital Chinese Medicine(2022年2期)2022-07-02姜黄素抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭并诱导凋亡的作用研究九江学院学报(自然科学版)(2022年2期)2022-07-02氧化槐定碱体内体外通过AKT/mTOR通路调控自噬抑制HBV诱发肝纤维化世界科学技术-中医药现代化(2022年2期)2022-05-25小檗碱治疗非酒精性脂肪肝病相关通路的研究进展现代临床医学(2021年4期)2021-07-31黄芩素对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭转移的影响及其相关机制新乡医学院学报(2021年5期)2021-06-19槲皮素对非对称性二甲基精氨酸诱导损伤的脑血管内皮细胞的保护作用及其机制研究中国脑血管病杂志(2019年2期)2019-08-28Curcumin in The Treatment of in Animals Myocardial ischemia reperfusion: A Systematic review and Meta-analysisMedical Data Mining(2019年2期)2019-07-16氮磷钾素对朝阳大枣生长及产量的影响现代农业科技(2018年16期)2018-10-12药食两用的姜黄文萃报·周五版(2018年25期)2018-08-13