白银阳，熊 芳，张 昀，汪 敏，陈 洁
(无锡市妇幼保健院生殖医学中心，无锡 214002)
在人类辅助生殖技术中，卵母细胞给予胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后仍存在受精失败、胚胎卵裂率低、胚胎发育阻滞等问题，这主要与卵母细胞的激活失败密切相关[1-2]。细胞内质网Ca2+大量释放(即钙震荡)是激活卵母细胞的关键[3]。对于激活失败的卵母细胞,外源性补充Ca2+载体能提高受精率，促进胚胎卵裂和囊胚形成[4-7]。既往研究多将Ca2+载体应用于ICSI受精失败的患者。然而临床上有部分ICSI助孕患者，即使能正常受精，胚胎卵裂过程中仍出现发育缓慢甚至阻滞、无可移植胚胎的问题。目前关于Ca2+载体在这类患者中应用的研究较少。本研究募集行ICSI助孕中出现胚胎发育缓慢或阻滞，囊胚形成率低的患者60例，再次ICSI助孕时卵母细胞给予Ca2+载体A23817进行激活，观察A23817对患者的受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率以及妊娠结局的影响。
1.1 研究对象 募集2019年1月至2021年7月于无锡市妇幼保健院生殖医学中心行ICSI助孕治疗的患者60例，再次ICSI助孕时，卵母细胞给予Ca2+载体A23817进行激活，进行前后两周期的自身对照研究。入选标准：(1)女方年龄22～36岁；
(2)不孕原因为男方严重少弱精子症或梗阻性无精子症；
(3)已行ICSI助孕治疗1个周期以上;(4)既往ICSI周期中曾出现胚胎发育缓慢或停滞、囊胚形成率低等现象。本研究经无锡市妇幼保健院伦理委员会批准。患者均签订知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 促排卵 采用温和刺激方案，主要促排卵药物为克罗米芬(法地兰高特制药)和尿促性素(HMG,丽珠制药)，B超示4枚主导卵泡直径达到17mm或3枚主导卵泡直径达到18mm。予绒促性素(HCG，丽珠制药)1万IU扳机，HCG应用后34～36h取卵。
1.2.2 囊胚冷冻 对照组MⅡ期卵母细胞按常规ICSI流程处理，激活组MⅡ期卵母细胞行ICSI注射后立刻置于30μL含Ca2+载体A23817的激活液微滴(GM508 Cult-Active，Gynemed，德国)，37℃、6%CO2培养箱中孵育15min。培养液洗涤3次，置常规胚胎培养液继续培养。每天观察卵裂情况，按形态学标准评价胚胎级别至D3，如有可移植胚胎，D3冷冻2枚胚胎，其余胚胎囊胚培养至D5或D6，观察囊胚形成情况，并行囊胚冷冻。
1.2.3 冻胚移植 患者卵巢大小及内分泌激素恢复正常后行人工周期准备内膜，首选囊胚移植，如无囊胚，则移植卵裂期胚胎，黄体支持采用本科室标准方案至孕10周。
1.2.4 妊娠测定 胚胎移植后12d检测血清β-HCG≥5IU/L定义为HCG阳性，胚胎移植后30d B超检测见宫内孕囊诊断临床妊娠。
1.2.5 观察指标 受精率(2PN率)=正常受精卵数(2PN数)/ICSI注射数×100%；
胚胎卵裂率=卵裂胚胎数/2PN数×100%；
可移植胚胎率=可移植胚胎数/2PN数×100%；
优质胚胎率=优质胚胎数/2PN数×100%；
囊胚形成率=囊胚形成数/养囊胚胎数×100%；
种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；
血HCG阳性率=HCG阳性周期数/移植周期数×100%；
临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%，活产率=活产周期数/移植周期数×100%。
2.1 患者一般情况 患者在前后两个周期中的体质量指数(body mass index,BMI)、基础内分泌(bFSH、bLH、bE2以及AMH比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。
表1 患者基本资料
2.2 患者的胚胎发育情况 患者在两个周期的平均MⅡ卵数和受精率无显著差异(P>0.05)。A23187组的胚胎卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率及囊胚形成率均显著高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.01)，见表2。
表2 两组胚胎发育情况比较
2.3 患者妊娠结局比较 对照组中33例患者有可移植胚胎，其中1例胚胎解冻时退化，32例进行胚胎移植。A23187组中52例有可移植胚胎均进行胚胎移植。A23187组的胚胎种植率、血HCG阳性率、临床妊娠率及活产率均明显高于对照组，流产率明显低于对照组，差异有统计学意义(均P<0.01)。A23187组临床妊娠患者中有2例为双胎妊娠，其中1例孕早期一胎胚胎停育，转为单胎，1例双胎分娩，最终分娩25例活婴，产后随访均未发现新生儿出生缺陷。对照组临床妊娠患者均为单胎妊娠，无分娩者。见表3。
表3 两组妊娠结局比较
Ca2+是人类细胞中最主要的信号传递介质之一。细胞内质网Ca2+大量释放和胞外Ca2+内流，胞内Ca2+浓度急剧升高(即钙震荡)是激活卵母细胞的关键环节。细胞内质网Ca2+储存池的脉冲式释放是Ca2+的主要来源，这一过程主要通过精子特异性磷脂酶Cζ(PLCζ)诱导的三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate，IP3)通路完成的[8]。细胞外Ca2+主要通过跨膜转运进入细胞内，Ca2+载体对于这一膜转运过程发挥重要的作用[9]。当内质网Ca2+储存池内钙缺乏时，卵母细胞不能正常激活，导致受精失败，此时需补充外源性Ca2+来弥补胞内钙缺乏。Ca2+载体通过细胞外Ca2+的跨膜转运，诱导卵母细胞内Ca2+浓度迅速升高(即钙震荡)，激活卵母细胞，维持受精[3,9]。
既往大多数研究将Ca2+载体激活应用于低受精率或受精失败的ICSI助孕患者，并且一致认为Ca2+载体能显著提高受精率，改善患者妊娠结局[4-7]。然而在排除受精因素后，Ca2+载体激活能否促进胚胎发育，提高胚胎质量仍存争议。本研究发现，在受精率正常、胚胎发育缓慢和阻滞的ICSI助孕患者，Ca2+载体能明显改善胚胎质量，促进囊胚形成，改善患者的临床妊娠结局，提高活产率。这些临床结果与国外一项前瞻性多中心研究一致。该研究募集胚胎发育缓慢或阻滞的ICSI助孕患者，并排除了受精率小于30%的患者，结果发现Ca2+载体激活后患者的胚胎卵裂率和囊胚形成率显著提高，而受精率无显著差异[10]。但该研究为多中心研究数据，不能排除患者促排卵方案和胚胎培养环境的差异。本研究对象均为本中心ICSI助孕患者，患者前后两个周期的促排卵方案及胚胎培养环境基本相同。尽管这样，仍不能完全摒除患者自身状况在Ca2+载体激活前后两个周期间的微小差异和外源性干扰因素的潜在影响。近期研究进一步证实，Ca2+载体激活促进细胞周期分裂的同步性，提高囊胚利用率[11]。但也有研究显示，在前次ICSI助孕D5囊胚质量差的患者中,Ca2+载体激活并不能改变受精率和囊胚的质量，但患者例数太少(19例)，未进一步观察Ca2+载体激活对妊娠结局的影响[12]。
除正常受精外，钙震荡还影响胚胎后期的发育和基因表达[11]。研究发现，对于同时存在胚胎卵裂率低或胚胎质量差的ICSI受精失败患者，给予卵母细胞人工辅助激活不仅提高受精率，还能明显改善后期胚胎卵裂和囊胚的形成[13]。Ca2+载体在胚胎发育阻滞、缓慢以及囊胚形成率低的患者中有显著作用，推测Ca2+载体激活可能参与卵母细胞活化早期事件的启动和完成，但可能长期促进胚胎发育。尽管Ca2+震荡是在卵母细胞ICSI受精后立即产生的[3]，Ca2+载体能维持胚胎后期发育过程中所需要的充足的钙供应。在细胞有丝分裂阻滞或Ca2+通道缺乏的细胞周期中，应用Ca2+载体能明显改善细胞分裂，并且Ca2+载体在细胞分裂的初始阶段即发挥至关重要的作用[14]。此外，Ca2+震荡波还能促使成熟卵母细胞进行正常减数分裂。研究发现，卵母细胞的减数分裂阻滞大多是由Ca2+通道缺失引起的[15]。因此，Ca2+载体对于细胞有丝分裂和减数分裂中任何阶段阻滞均具有改善作用。在生理性或病理性钙缺乏的ICSI助孕患者中易发生胚胎卵裂阻滞的问题[16]，进一步证实Ca2+在胚胎卵裂过程中的重要作用。本研究发现，在胚胎发育阻滞或缓慢的患者中，Ca2+载体能明显促进胚胎的卵裂和囊胚的形成，改善胚胎质量。然而未发现Ca2+载体对受精率的显著影响，分析原因可能为本研究募集的是ICSI注射后能正常受精的患者，受精过程不需要外源性钙离子进行辅助激活，因此其对受精的影响作用不明显。由此推测，除导致受精失败外，卵母细胞激活过程中Ca2+信号不足还可能影响后期的胚胎卵裂，导致胚胎质量差，囊胚形成率低等问题。
引起胚胎发育缓慢或阻滞的原因较复杂，除精源性因素外，还有可能是卵母细胞自身的异常。研究发现，Ca2+载体激活能显著提高年轻及卵巢功能正常患者的受精率、囊胚形成率和囊胚质量，并不能改善高龄或卵巢储备低下患者的受精和胚胎质量[7]。老年女性的卵母细胞进行Ca2+内流的能力严重受损，但卵母细胞装载正常精子和PLCζ诱导的Ca2+振荡特性的能力几乎不受影响。因此可能是卵母细胞激活失败以外的因素，如与年龄相关的卵母细胞非整倍体，线粒体DNA损伤以及线粒体功能障碍等均影响着胚胎发育和胚胎质量[17]。因此，本研究募集的人群是年轻(22～36岁)且卵巢功能正常者，尽可能减少卵源性因素对受精和胚胎的潜在影响。此外，本研究采用自身对照，为避免前后两个周期的个体变化，尽量缩短受试对象前后两个周期助孕的间隔时间，并且再次ICSI助孕时受试对象重新接受体重、卵巢功能等指标的评估，这些指标在前后两个周期中均无显著差异。为减少外源性因素对胚胎结局的影响，本研究募集的患者在激活前后两个周期均采用以克罗米芬和尿促性素为主要促排卵药物的温和刺激方案，激活周期根据患者前次助孕的反应性仅做药物剂量微小的调整。由于克罗米芬的抗雌激素效应，其对子宫内膜容受性有一定的负面影响，因此患者全部采用冻胚移植,并且冻胚移植周期均采用人工周期方案准备内膜。尽管玻璃化冷冻及胚胎复苏操作对胚胎的影响较小，但仍不能完全排除其对胚胎潜在影响。
随着Ca2+载体在辅助生殖领域的不断应用，其作为一项新技术，其安全性也成了人们关注的焦点。研究发现，Ca2+载体不会影响卵母细胞减数分裂中染色体的正常分离[18]。有关Ca2+载体激活出生的儿童健康随访研究发现，Ca2+载体激活后出生儿童的体重、性别比、出生缺陷率及类型，智力发育、语言和社会行为能力等方面均与常规ICSI出生的儿童无显著差异[19-20]。本研究随访Ca2+载体激活组患者分娩的25例新生儿，均未发现新生儿出生缺陷。目前的数据尚未发现Ca2+载体对子代的不良影响，但由于研究样本量较少，观察周期的时限性等问题，Ca2+载体对子代的安全性问题还需大样本的研究和长期的随访观察进一步论证。
总之，Ca2+载体对胚胎发育阻滞或缓慢患者胚胎卵裂和妊娠结局有改善作用，是Ca2+载体应用领域的新突破，对于ICSI助孕中反复出现胚胎结局不良的年轻患者，Ca2+载体辅助激活带来孕育新生命的希望。但目前研究样本量有限，Ca2+载体对胚胎发育的影响及其安全性还需大规模多中心前瞻性研究进行论证。
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