战 磊，王 寒，关罗浩，张蒙蒙，梁俊阳，张晓瑞，付 博，王玉胜
（1. 广东中烟工业有限责任公司 技术中心，广东 广州 510385；
2. 河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002）
烟叶是卷烟工业的基础，其品质的优劣对卷烟品质起着举足轻重的作用[1]。烟叶的内在化学成分是烟叶品质形成的物质基础，也是烟叶品质优劣的关键因素[2]。我国烤烟普遍存在淀粉含量过高、内在化学成分不协调等问题，导致工业可用性降低。淀粉作为烟叶中的大分子化合物对烟叶品质有着重要的影响[3]。烟叶通过调制后，部分淀粉会降解而转化为糖。目前，国内烤烟烤后淀粉残留量较高，这些化合物对卷烟吸食品质有不良影响，使得烟叶在卷烟生产中的应用受到了较大限制[4]。在一定范围内，烟叶感官质量随淀粉含量的下降而提升。
近年来，利用微生物发酵降低烟叶中的淀粉含量已成为提高烟叶品质研究的热点[5]。覃明娟等[6]研究表明，植物乳杆菌能显著改善烟叶品质及烟叶香吃味。冯颖杰等[7]发现1 株高产淀粉酶的苏云金芽孢杆菌，该菌能在生长和代谢过程中产生淀粉酶，将烟叶中的淀粉降解为还原糖。还原糖裂解有利于平衡烟气酸碱性、协调香气[8⁃9]。在烟叶发酵过程中，提高产酶菌株的淀粉酶活性可提高淀粉的降解效率，提升烟叶品质并缩短反应时间[10]。不同菌株的产酶能力又受到营养成分和发酵条件的影响[11⁃12]。因此，对菌株的培养基组分及发酵条件进行优化，能最大限度地提升菌株的产酶能力[13]。在以往菌株产酶优化研究中多采用正交试验[14]，而Box-Benhnken 设计结合响应面分析法较正交试验法简便易行，且结果真实可靠。笔者所在课题组前期研究得到1 株产淀粉酶苏云金芽孢杆菌，能够显著提升高淀粉含量烟叶的品质，为了实现研究成果应用，以淀粉酶活性为指标，结合单因素试验和Box-Benhnken 响应面试验优化苏云金芽孢杆菌产淀粉酶的最佳工艺，并将优化后的粗酶液应用于烟叶发酵进行效果验证，以期为产淀粉酶苏云金芽孢杆菌的工业化应用提供依据。
1.1 试验材料
菌株：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SY-1 菌株（以下简称SY-1 菌株），由河南农业大学烟草加工实验室分离和筛选。
烟叶：烟叶样品由广东中烟工业有限责任公司提供，选用淀粉含量最高的原料作为试验样品。烟叶化学成分含量：淀粉8.53%、总糖30.48%、还原糖24.76%、烟碱2.27%、总氮1.90%。
种子培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 3 g/L，pH值为7.0，高压灭菌。
产酶培养基：可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 3 g/L，pH值为7.0，高压灭菌。
1.2 试验方法
1.2.1 SY-1 菌株粗酶液的获取 将活化后的苏云金芽孢杆菌SY-1 接种至产酶培养基中，在35 ℃条件下，160 r/min 发酵培养24 h，将发酵液在4 ℃条件下、8 000 r/min 离心10 min。参考陈蕊等[15]的方法制备粗酶液，酶活性检测方法参考文献[16]中的方法。
1.2.2 SY-1菌株产酶单因素试验
1.2.2.1 碳源对SY-1 菌株产淀粉酶的影响 在产酶培养基的基础上分别以10 g/L 葡萄糖、10 g/L 蔗糖、10 g/L 玉米淀粉、10 g/L 可溶性淀粉、10 g/L 可溶性淀粉+玉米淀粉混合物（m可溶性淀粉∶m玉米淀粉=1∶1，下同）为碳源，研究培养基最佳碳源组成；
为考察碳源质量浓度，设置质量浓度分别为5、10、15、20、25 g/L。发酵条件：35 ℃、160 r/min条件下发酵培养24 h。
1.2.2.2 氮源对SY-1 菌株产淀粉酶的影响 在产酶培养基的基础上以10 g/L 蛋白胨、10 g/L NH4NO3、10 g/L 酵母粉、10 g/L 尿素、10 g/L 蛋白胨+酵母粉混合物（m蛋白胨∶m酵母粉=1∶1，下同）为氮源，以酶活性为指标，得到最佳氮源；
设置最佳氮源的质量浓度分别为5、10、15、20、25 g/L。发酵条件同1.2.2.1。
1.2.2.3 无机盐对SY-1 菌株产淀粉酶的影响 在产酶培养基的基础上分别以3 g/L NaCl、3 g/L CaCl2、3 g/L KNO3、3 g/L MgSO4、3 g/L MnSO4作为无机盐，以酶活性为指标，得到最佳无机盐；
设置最佳无机盐的质量浓度分别为1、5、9、13、17 g/L，发酵条件同1.2.2.1。
1.2.2.4 培养温度对SY-1 菌株产淀粉酶的影响
可溶性淀粉+玉米淀粉15 g/L 为碳源，蛋白胨+酵母粉20 g/L 为氮源，CaCl2为5 g/L，设置发酵培养温度分别为25、30、35、40 ℃，160 r/min 培养24 h，测定菌株酶活性。
1.2.2.5 转速对SY-1 菌株产淀粉酶的影响 以可溶性淀粉+玉米淀粉15 g/L 为碳源，蛋白胨+酵母粉20 g/L 为氮源，CaCl2为5 g/L，设置转速分别为140、160、180、200、220 r/min，35 ℃培养24 h，测定菌株酶活性。
1.2.3 SY-1 菌株产酶响应面试验 采用Design Expert 11 软件对菌株产酶条件进行响应面试验设计，在单因素试验的基础上，对可溶性淀粉+玉米淀粉、蛋白胨+酵母粉、CaCl2、培养温度、转速等因素各设计3个水平（表1）。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design
1.2.4 粗酶液降解烟叶淀粉的作用效果分析 烟叶原料经回潮、切丝后，将菌株SY-1 产酶条件优化前及优化后的粗酶液均匀喷施于烟丝表面，以喷施同等比例蒸馏水为对照，并分别调整烟丝含水率至18%，于恒温恒湿箱中35 ℃发酵48 h。发酵后烟丝于80 ℃烘箱中干燥5 min，对菌株粗酶液进行灭活。
1.2.5 烟叶中化学成分测定 烟叶中淀粉含量采用《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》（YC/T 216—2013）中的方法测定，常规化学成分含量分别采用《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》（YC/T 159—2002）、《烟草及烟草制品总植物碱的测定 连续流动法》（YC/T 160—2002）和《烟草及烟草制品总氮的测定 连续流动法》（YC/T 161—2002）等方法进行测定。烟叶淀粉降解率=（对照烟叶中淀粉含量-处理后烟叶中淀粉含量）/对照烟叶中淀粉含量×100%。
1.2.6 数据分析 所有处理均重复测试3 次，采用Design Expert 11、SPSS 17.0 软件进行数据处理，并用Origin 2019软件绘图。
2.1 SY-1菌株产酶条件单因素试验结果
2.1.1 碳源对SY-1菌株淀粉酶活性的影响 由图1可知，以可溶性淀粉、玉米淀粉为碳源时，SY-1菌株淀粉酶活性均高于蔗糖和葡萄糖；
相较于单一淀粉，SY-1 菌株以可溶性淀粉+玉米淀粉为碳源时，菌株淀粉酶活性更高。因此，选择可溶性淀粉+玉米淀粉为SY-1菌株的最适碳源。
图1 碳源种类对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.1 Effects of carbon source species on amylase activity of SY-1 strain
随着混合淀粉质量浓度的增加，SY-1菌株淀粉酶活性先升高后降低，当可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度为15 g/L 时酶活性最高（图2）。因此，选择15 g/L 可溶性淀粉+玉米淀粉为发酵培养基最适碳源添加量。
图2 可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.2 Effects of soluble starch+corn starch concentration on amylase activity of SY-1 strain
2.1.2 氮源对SY-1菌株淀粉酶活性的影响 由图3
图3 氮源种类对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.3 Effects of nitrogen source species on amylase activity of SY-1 strain
可知，有机氮源的酶活性明显高于无机氮源。相较于尿素、硝酸铵，以蛋白胨、酵母粉作为氮源时，SY-1 菌株淀粉酶活性较高，其中以蛋白胨+酵母粉作为混合氮源时，酶活性最高。因此，选择蛋白胨+酵母粉为最适氮源。
蛋白胨+酵母粉质量浓度在一定范围内可促进SY-1 菌株淀粉酶的产生，质量浓度为15 g/L 时，酶活性最高（图4）。
图4 蛋白胨+酵母粉质量浓度对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.4 Effects of peptone+yeast powder concentration on amylase activity of SY-1 strain
2.1.3 无机盐对SY-1 菌株淀粉酶活性的影响 相较于NaCl、KNO3、MgSO4、MnSO4，CaCl2作为无机盐时酶活性最高（图5）。当CaCl2质量浓度为5 g/L时，SY-1菌株淀粉酶活性最高（图6）。
图5 无机盐种类对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.5 Effects of inorganic salt species on amylase activity of SY-1 strain
图6 CaCl2质量浓度对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.6 Effects of CaCl2 concentration on amylase activity of SY-1 strain
2.1.4 培养温度和转速对SY-1 菌株淀粉酶活性的影响 随着培养温度的升高，SY-1菌株淀粉酶活性逐渐增加，在35 ℃时，SY-1 菌株淀粉酶活性最高；
在35～40 ℃时，随着温度的升高SY-1菌株淀粉酶活性呈现下降趋势（图7）。温度过高时，蛋白质结构容易发生改变或变性，使酶活性降低[17]。转速对酶活性有较大的影响，SY-1菌株淀粉酶活性随着转速增加先增大后减小，最适转速为180 r/min（图8）。
图7 培养温度对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.7 Effects of culture temperature on amylase activity of SY-1 strain
图8 转速对SY-1菌株淀粉酶活性的影响Fig.8 Effects of rotation speed on amylase activity of SY-1 strain
2.2 SY-1菌株产酶条件响应面优化试验结果
2.2.1 回归方程建立 利用Design Expert软件分析响应面试验数据，建立多元回归模型，拟合得到回归方程：
其中，Y为菌株淀粉酶活性，A、B、C、D和E分别为可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度、蛋白胨+酵母粉质量浓度、CaCl2质量浓度、培养温度和转速。
方差分析（表2）表明，模型F=56.29，P<0.000 1，表明回归模型拟合度高。R2为0.978 3，表明回归方程与对应的响应值的吻合程度能达到97.83%。R2Pred=0.957 0 和R2Adj=0.960 9 均接近于1。因此，可以用该回归方程对SY-1 菌株产酶条件的评价指标进行预测。
表2 回归模型方差分析结果Tab.2 Analysis of variance of regression model
2.2.2 各因素之间的交互作用 三维响应面分析结果显示（图9），随着可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度和蛋白胨+酵母粉质量浓度的增加，菌株淀粉酶活性逐渐增加，但是均存在峰值。可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度对响应值的影响较蛋白胨+酵母粉质量浓度影响更显著。另外，两因素的交互作用较强。CaCl2质量浓度与淀粉酶活性呈正相关，但是其对菌株淀粉酶活性的影响弱于可溶性淀粉+玉米淀粉。可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度与培养温度两因素的交互作用较强，影响显著。转速与淀粉酶活性呈正相关，其对淀粉酶活性的影响较可溶性淀粉+玉米淀粉强，并且两因素的交互作用较强。蛋白胨+酵母粉对淀粉酶活性的影响较CaCl2更显著。当蛋白胨+酵母粉质量浓度在10～15 g/L 时，随着质量浓度的增加，淀粉酶活性缓慢增加；
当质量浓度>15 g/L时，淀粉酶活性随着质量浓度的增加呈现下降趋势。培养温度对淀粉酶活性的影响较蛋白胨+酵母粉显著，交互作用不显著。转速对淀粉酶活性的影响较蛋白胨+酵母粉显著，交互作用较为显著。培养温度对淀粉酶活性的影响较CaCl2更显著。CaCl2质量浓度和转速单因素对淀粉酶活性均具有显著影响，但两者交互作用不显著。培养温度与转速间的交互作用不显著。
图9 各因素交互作用对淀粉酶活性的影响Fig.9 Effects of interaction between different factors on amylase activity
续表2 回归模型方差分析结果Tab.2（Continued） Analysis of variance of regression model
综上所述，蛋白胨+酵母粉质量浓度与转速的交互作用显著，可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度与培养温度、可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度与转速、蛋白胨+酵母粉质量浓度与CaCl2质量浓度、CaCl2质量浓度与培养温度的交互作用极显著，影响淀粉酶活性的主次因素为转速>培养温度>可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度>蛋白胨+酵母粉质量浓度>CaCl2质量浓度。
2.2.3 响应面试验方案优化及结果验证 响应面试验结果显示，培养基的最佳配方为可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度15.69 g/L、蛋白胨+酵母粉质量浓 度16.87 g/L、CaCl2质 量 浓 度5.91 g/L，温 度 为36.83 ℃、转速为189.71 r/min，此时理论酶活性为223.18 U/mL。对最佳培养条件进行验证，得到酶活性为223.45 U/mL，与理论值基本吻合。与初始酶活性（116.05 U/mL）相比，酶活性提高92.55%。
2.3 发酵前后烟叶中淀粉含量及常规化学成分含量变化
以蒸馏水处理为对照，分析SY-1 菌株发酵条件优化前后所产酶液对烟叶中淀粉及常规化学成分含量的影响。与对照相比，经酶液处理后烟叶淀粉含量均显著降低（表3）。产酶条件优化前，SY-1酶液对烟叶淀粉的降解率为16.88%；
产酶条件优化后，SY-1 酶液对烟叶淀粉的降解率达40.68%。与优化前酶液处理相比，优化后酶液处理水溶性总糖和还原糖含量分别提高5.91%和7.84%；
总氮含量和烟碱含量分别下降4.23%和2.84%，糖碱比、氮碱比得到提升，两糖差有所下降。降低两糖差有利于提高烟叶吃味品质，且烟叶烟气醇和度及香气与还原糖呈极显著正相关，还原糖是香气前提，对烟叶感官质量有显著影响[17⁃18]。
表3 发酵前后烟叶中淀粉含量及常规化学成分含量变化Tab.3 Changes of starch and conventional chemical composition content of tobacco leaves before and after fermentation
苏云金芽孢杆菌SY-1 以混合淀粉为碳源时酶活性最高，是因为淀粉作为多糖，除了能被微生物分解成葡萄糖外还能提供麦芽糖，能保证菌株的多元化营养，且混合淀粉中含有更丰富的营养物质以及多种矿质元素，从而促进了菌体的繁殖和芽孢的形成，增强了微生物代谢活力，从而提高了淀粉酶活性[19]。有机氮源的酶活性明显高于无机氮源。这是因为有机氮源含有丰富的氨基酸、维生素及生长因子等营养物质，其中氨基酸可直接参与微生物体内的转氨或脱氨作用[20]，维生素可作为一些酶的辅因子参与胞内生命活动[21]。相较于单一有机氮源，蛋白胨+酵母粉作为混合氮源时酶活性最高，由于酵母粉蛋白质分子比蛋白胨分子小，有利于菌体吸收，促进菌体生长；
蛋白胨则有利于菌体稳定期的延长，促进菌体代谢及产酶[22]。陈宇熹等[23]认为，Ca2+有利于芽孢的形成，并且对发酵液pH 值具有调节作用，与本研究结果一致。不同菌株的最适培养温度不同，经产酶优化后的苏云金芽孢杆菌最适培养温度与枯草芽孢杆菌[24]最适温度37 ℃接近。转速较杨磊等[25]研究中的转速150 r/min 高，适当增大转速能增大瓶内溶氧量，发酵液中传质和传热速度加快，有利于菌体生长代谢与产酶；
转速太高，溶氧量高于菌体所需水平，会导致培养基中有气泡产生，影响菌体呼吸，从而影响菌体生长及产酶[26]。
通过产酶条件的单因素试验及Box-Behnken响应面设计试验，分析得到最佳产酶条件：可溶性淀粉+玉米淀粉质量浓度15.69 g/L，蛋白胨+酵母粉质量浓度16.87 g/L，CaCl2质量浓度5.91 g/L，温度为36.83 ℃、转速为189.71 r/min。SY-1 菌株在经过产酶条件优化后，淀粉酶活性达223.45 U/mL，与发酵条件优化前相比，酶活性提高92.55%，明显高于聂晶晶等[27]报道的解淀粉芽孢杆菌淀粉酶活性（70.2 U/mL）。
苏云金芽孢杆菌SY-1 经产酶条件优化后的酶液具有更高效的烟叶淀粉降解能力，淀粉降解率提高23.80 个百分点。淀粉含量过高不仅会影响燃吸的速度和完全性，还会产生焦糊气味以及多种有害成分，降低了卷烟的安全性[28]。目前，调制后烟叶淀粉含量普遍偏高，已成为制约我国烟叶质量提高的重要因素[4]。烟叶中的淀粉可通过降解转化为还原糖等小分子物质，进而促进香味物质的生成，改善抽吸品质[29]。提高苏云金芽孢杆菌SY-1 的淀粉酶活性能够显著提高烟叶淀粉的降解效率并提高烟叶品质。
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