欧阳慧丽，王帅，陈超，陆温，郑霞林，王小云
（广西农业环境与农产品安全重点实验室 广西大学农学院 南宁市 530004）
橘小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）又名东方果实蝇、柑橘小实蝇，俗称针蜂、柑蛆、果蛆、黄苍蝇，隶属双翅目Diptera，实蝇科Trypetidae，寡毛实蝇亚科Dacinae，果实蝇属Bactrocera，是一种重要的世界性入侵害虫[1]。其寄主范围广，可危害46科250多种水果蔬菜[2]，雌成虫将卵产在果皮下，幼虫潜居果实内部，取食果肉获取生长所需养分，破坏果实内部组织结构，造成果实腐烂或未熟先黄脱落，给水果产业带来严重的经济损失[3-4]。广西处于亚热带地区，气候温暖，雨水丰沛，适宜多种水果蔬菜的种植，果蔬种类及产量均居全国前列，也是橘小实蝇最早入侵我国的地区之一[5]，其监测和防控尤为重要。
线粒体DNA（mt DNA）是一个闭合环状双链DNA，在昆虫体内广泛分布，其进化速率较核DNA更快，严格遵守母系遗传特点，即遗传过程不发生基因重组、倒位、易位等突变。通过碱基的插入、缺失而增加或减少限制性酶切位点，PCR反应后测序，便可以得到丰富的核苷酸多样性、单倍型多样性等多态信息[6]。mt DNA序列片段分析已被广泛用于入侵性果实蝇的种群结构、种群遗传分化、种群遗传多样性和扩散路线研究[7]。Li等[8]利用640 bp长度的mt DNA COI基因片段对来自缅甸、老挝及中国3个国家15个地理种群的242头橘小实蝇进行种群结构及扩散路径的研究，结果表明东南亚地区很有可能是该虫的起源地。Mun等[8]利用mt DNA的COI基因多样性和3个核酸位点，分析发现在日本横滨新入侵的南瓜实蝇Bactrocera tau种群的线粒体单元型和在韩国广泛分布的种群非常接近。吴广超等[10]利用774 bp的mt DNA基因研究了橘小实蝇的缅甸与中国海南、云南、广西、湖南等13个地理种群213个个体，提出云南是该种入侵中国的最早地区，次年进一步证实这一结论。施伟等[11]对云南省瑞丽、景洪、化念、元江和河口的橘小实蝇种群，共27个个体的线粒体COI基因，进行了部分测序后发现这5个地理种群间存在较低水平的遗传分化，主要与地理隔离有关。王巧铃等[12]利用153 5 bp mt DNA COI基因研究了印度、缅甸、泰国、老挝、越南、中国19个种群380个个体，证明橘小实蝇有从南到北，沿海到内陆的扩散趋势[12]。从分子水平上探索广西区橘小实蝇的种群扩散路径和种群结构，可为优化橘小实蝇在广西区的防治方案提供基础资料。
因此，本研究收集了广西区橘小实蝇17个地理种群，通过DNA测序获得所有供试昆虫mt COI基因序列信息，对广西不同地理种群的橘小实蝇基因信息、遗传多样性、遗传分化和种群亲缘关系进行了研究，为橘小实蝇的监测和综合防治提供参考依据。
1.1 供试昆虫
供试橘小实蝇共有17个种群117头成虫，由广西区各地植保站采集虫果，室内培育羽化得到供试实蝇。样本信息如表1所示，每个采集地点用相应的种群代码表示。所有橘小实蝇成虫经形态学鉴定，确认无误后用无水乙醇浸泡，于-20℃保存。
表1 橘小实蝇不同地理种群样本采集信息
（接上表）
1.2 DNA提取
取橘小实蝇单头成虫，使用DNeasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN，德国）试剂盒按照说明书步骤提取总DNA。DNA样品于-20℃保存备用。
1.3 PCR扩增及序列测定
线 粒 体COI基 因（mt DNA COI）片 段 由Hco2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC）和Lco1490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG）两对引物进行PCR扩增[14]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，PCR试剂为2xTaq PCR MasterMix II（takara，中国）。
PCR反应体系为40μL：12μL模板DNA，20 μL 2xTaq酶，上下游引物各0.5 mmol/L，加ddH2O至总体积为40μL。PCR扩增反应条件为：95℃下初始变性3 min，95℃下变性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，完成35次循环。最后72℃下延伸5 min，于4℃下保存。PCR反应在Applied Biosystems ABI 3 730（Applied Biosystem，USA）上进行。使用1%琼脂糖凝胶检测PCR产物，检测结果为阳性后委托广州生物工程股份有限公司进行测序，所有序列采用双向测序以保证序列的准确性。
1.4 数据分析
所得序列通过BioEdit 7.0及DNAMAN 6.0进行剪切和拼接，最终获得667 bp的mt COI序列。在软件MEGA 7.0[15]中进行序列比对，计算多态性位点数、简约信息位点数和自裔位点数，并基于碱基转换和颠换的Kimura双参数模型，计算各种群两两之间的遗传距离，基于遗传距离矩阵，以邻接法（Neighbor-Joiningmethod，NJ）构建种群系统发育树。以DnaSP 5.0软件[16]对COI序列进行单倍型判定，碱基排列完全相同的序列为同一单倍型，同时计算单倍型数目（the number of haplotypes，HN）、中性检验（Tests of selectiveneutrality）、错配分布（Mismatch distribution）、单倍型多样性（Haplotype diversity，Hd）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，Nd）、平均核苷酸差异（average number of nucleotide differences，K）及其相应标准偏差（SD）。由软件Arlequin 3.5[17]完成种群间遗传分化系数FST及基因流Nm计算（海岛模式：公式Fst=1/（4Nm+1）），换算出基因流Nm值。以Excel插件XLSTAT（https：//www.xlstat.com/en/）计算两方面内容：遗传多样性指数与样本数量之间的Pearson相关系数；
完成Mantel检验，分析地理距离和遗传分化系数间的相关性。由Network 10.0[18]软件构建单倍型网络图，并对图进行调整和校对。
2.1 遗传多样性分析
在所有样品中最终获得准确一致的长为667 bp的线粒体DNA COI基因部分序列条中，4种核苷酸的平均碱基含量为：A（35.23%）＞T（29.33%）＞G（18.59%）＞C（16.85%），有明显的A+T偏向性，其线粒体DNA的碱基组成类似于其他双翅目果实蝇属昆虫[18]。在667个碱基中共检测到保守位点（conserved sites，c）529个，变异位点（variable sites，v）138个，其中包括自裔位点（singleton sites，s）23个和简约信息位点（parsimony-informative site，pi）115个；
在碱基的替换中，85个位点发生了转换，34个位点发生了颠换，19个位点同时发生了转换和颠换，所有多态性位点全部由碱基的替换产生，未发现插入和缺失。
mt DNA COI基因标记遗传多样性分析（表2）显示，17个地理种群橘小实蝇样本整体的单倍型多样性为0.958，核苷酸多样性为0.008 55，平均核苷酸差异数为5.702 17，显示出较高水平的遗传多样性，各种群的遗传多样性指数表现出一定的差异。此外，各种群的样本数量与核苷酸多样性、平均核苷酸差异数、单倍型多样性的Pearson系数分别为0.171 1（P=0.576 3）、0.152 6（P=0.618 6）和0.154 0（P=0.615 4），表明种群间的遗传多样性差异与样本数量无关。由于桂林全州、柳州融安、梧州苍梧及贺州昭平4个地理种群样本数量为1，故不参与种群遗传多样性数值的统计。在单倍型多样性、核苷酸多样性和平均核苷酸差异3个参数中，防城港上思种群均明显大于其他地理种群，防城港东兴种群各项指标最低。防城港上思种群变异位点数最高，其次是崇左龙州种群，最低的是防城港东兴种群。百色田阳、桂林永福种群的单倍型多样性较大，玉林陆川、防城港东兴和南宁江南区种群的单倍型多样性明显偏小。防城港上思、桂林永福和桂林恭城的核苷酸多样性及平均核苷酸差异数值较大，防城港东兴、玉林陆川、贵港港南区的核苷酸多样性及平均核苷酸差异数值明显小于其他种群。通过以上分析表明，17个地理种群在地域上有较明显的多态性差异，防城港上思种群的遗传多样性相对较高，防城港东兴种群的遗传多样性相对较低。
表2 广西橘小实蝇不同地理种群遗传多样性指数
2.2 种群遗传分化分析
如表3所示，177条序列中共鉴定出82种单倍型，其中共享单倍型22种，其余60种均为独享单倍型。在22种共享单倍型中，9种单倍型为种群内共享（Hap23在玉林玉州区种群内；
Hap54在崇左龙州种群内；
Hap65在贵港港南区种群内；
Hap71在南宁江南区种群内；
Hap78和Hap79在桂林恭城种群内；
Hap72、Hap76和Hap77在南宁隆安种群内），13种单倍型在至少2个种群间共享。除样本数量小于3的种群外，独享单倍型在各种群中所占的比率普遍较高，表明这些种群之间已经出现了一定程度的遗传分化。
表3 广西橘小实蝇17个地理种群的单倍型分布表
（接上表）
种群遗传分化系数FST（F-statistic）和基因流（geneflow）是度量种群间的遗传分化程度和各种群间基因交流情况的重要指标。当FST＞0.25，表明种群间出现了极度的分化；
0.15＜FST＜0.25，表明群间出现了高度分化；
0.05＜FST＜0.15，表明种群间出现中度分化；
FST＜0.05时，表明两种群间基因型极度相似，即无遗传分化发生。当种群间基因流0＜Nm＜1时，两个种群之间由遗传漂变而发生了遗传分化；
当1＜Nm＜4时，两个种群之间发生了较低水平的遗传分化；
Nm＞4或为负值，两个种群之间基因交流频繁，在相当程度上阻碍了种群间的遗传分化[19]。种群间遗传分化系数与基因流关系如表4所示，结果显示，41.18%的FST值大于0.25，表明部分两种群间已出现极度分化，33.09%的FST值小于0.05，表明有部分地理种群间无遗传分化现象。其中桂林全州种群与梧州苍梧种群，贺州昭平与桂林全州、梧州苍梧种群，柳州融安与桂林全州、梧州苍梧、贺州昭平种群的FST值均为1，并且桂林永福种群与其他种群之间FST值均大于0.95，贵港港南区种群与其他种群间FST值均大于0.25，表明桂林永福种群、贵港港南区种群与其他种群间出现极度分化。所有种群间基因流Nm的最大值出现在北海铁山港种群与防城港上思种群之间（Nm=98.175 20），南宁隆安种群与百色田阳种群之间的基因流值最小（Nm=-397.075 34）。
表4 基于mt DNA COI基因橘小实蝇17个地理种群间遗传分化系数F ST和基因流N m
通常昆虫纲物种的线粒体COI基因的遗传距离差异达0.05左右时便可视为产生了种的分化，达0.02左右时产生亚种的分化。由表5显示，基于mt COI基因17个地理种群的橘小实蝇的遗传距离介于0.001到0.166之间，其中桂林永福种群与各种群间的遗传距离均大于其余16个种群相互间的遗传距离，其与南宁江南区种群的遗传距离接近0.02，而与其他所有种群间的遗传距离均大于0.05，种群间遗传距离差异明显，表明桂林永福与其他地理种群遗传差异更大。除桂林永福种群外16个橘小实蝇地理种群间遗传分化的程度均较弱，遗传距离值均小于0.02，遗传分化不明显。地理种群遗传距离和FST值与各种群间空间距离间的Mantel结果表明，2对矩阵之间不存在显著的相关性（R1=-0.073，P1=0.630；
R2=-0.073，P2=0.674），即橘小实蝇种群间的遗传分化程度与地理距离没有显著的相关性。
表5 基于mt DNA COI基因橘小实蝇17个地理种群间遗传距离
2.3 种群遗传结构
依据各种群的地理位置差异，将所有样品分为17个地理种群进行AMOVA（analysis of molecular variance）分析，如表6所示，发现种群间变异占45.26%，种群个体间变异占了54.74%，结果表明引起种群总体变异的主要因素还是种群内的个体间变异。
表6 橘小实蝇17个地理种群的分子变异分析（AMOVA）
在单倍型网络图（图1）中不同灰度代表一个地理种群，圆面积与单倍型频率成正比。总体呈现星状分布，进一步证实广西区橘小实蝇种群经历了种群扩张过程。单倍型Hap1出现频率最高，存在于11个地理种群中，Hap17次之，存在于4个种群中，低频率单倍型大多分布在单倍型网络外围，经一步或多步突变与高频率单倍型相连。各单倍型散乱分布，缺乏明显地理分布格局。南宁隆安单倍型（Hap73和Hap74）衍生于防城港上思（Hap46）和崇左龙州（Hap54）。南宁隆安种群与防城港上思种群的遗传分化系数（0.037 44）较崇左龙州种群的遗传分化系数（0.027 24）大，因而南宁隆安单倍型更有可能衍生于崇左龙州单倍型。
图1 广西17个橘小实蝇地理种群的单倍型网络图
邻接法建立的橘小实蝇地理种群系统发育树拓扑结构（图2）显示拥有共同单倍型的橘小实蝇种群基本汇在一起。桂林永福种群形成单独一支，其他种群在系统发育树上有一定的地理分布格局，但并非同一地理种群所有个体的序列都聚在一起。
图2 邻接法构建基于mt DNA COI基因序列的17个橘小实蝇地理种群系统进化树
2.4 种群历史动态
中性检验并结合错配分布（Mistmatch distibution）常用于群体历史动态推断[18]。中性检验运用Tajima"D和Fu"s Fs统计，结果显示中性检验的Tajima"D值为-2.516 40，为极显著性负值（P＜0.001），推断该群体经历了规模扩张及定向选择；
Fu"s Fs值为-85.957，且错配分布图（图3）呈单峰分布，说明本研究的橘小实蝇群体可能在历史上经历过突然扩张的事件。
图3 广西17个橘小实蝇地理种群的错配分析
橘小实蝇mt DNA COI序列片段碱基组成表现出明显的A+T偏好性，这符合脊椎动物线粒体基因的碱基组成明显偏好性的特点[20]。遗传距离结果表明，橘小实蝇种群间具有较高的遗传相似性，同时又存在一定的遗传分歧，证实mt DNA COI基因核苷酸碱基序列在一定程度上能够反映出橘小实蝇种群间的遗传相似性和差异性。聚类分析结果反映了橘小实蝇群体间具有一定的地理聚集分布格局，证明了可利用mt DNA COI基因序列开展橘小实蝇种群遗传多样性等相关研究。
遗传距离的大小反映地理种群间亲缘关系的远近[21]，玉林陆川与贺州昭平遗传距离最小，桂林永福与贵港港南区遗传距离最大，这与Mantel检测结果得出结论一致，即遗传分化大小与地理空间距离无关。推测可能橘小实蝇种群间高频率的迁移或扩散（如水果调运）克服了遗传漂变对种群的分化效应。
橘小实蝇种群高水平的遗传多样性，表明其对环境变化有着较强的适应能力，就其入侵性而言，复杂的种群结构更有利于定殖与扩散[22]。20世纪50年代后，橘小实蝇在广东、云南、广西、福建以及贵州等地发生。随后十年里橘小实蝇已跨越长江，达到了32°N的高纬度地区[23]。到20世纪80年代，该物种的种群数量急剧增加，分布范围扩大到中国南方的大部分地区，陆续在江西、湖北、浙江、上海、江苏、安徽和重庆等地区发现，其为害达到26°N的高纬度地区[24-25]。此外，北京、天津等地区也已成为橘小实蝇适生区[26-27]。广西区内，桂林整体遗传多样性指数突出，桂林永福的种群分化极显著，系统发育成独立的一个支系，很有可能与桂林广阔的水果种植面积以及丰富的种类有关。广西作为一个果蔬种植大省，仅柑橘类水果在广西水果总产量中就占有相当大的比例。据不完全统计，2020年广西柑橘种植面积可能已超过50万公顷。广西桂林居柑橘类水果产地榜首，橘小实蝇具有转移寄主危害的特性，广泛的寄主为桂林种群高度分化提供了条件[24]。贵港港南区为另一极度分化的地理种群，但桂林永福与贵港港南区遗传距离极显著，推测贵港地理种群高度的遗传分化现象可能是多次入侵的结果。
广西橘小实蝇不同地理种群之间基因交流Nm平均值为0.302 35，基因交流较频繁；
分子变异分析结果进一步证实，橘小实蝇群体的遗传变异主要来自于种群内部，不同地理种群间基因相互渗透，可能与橘小实蝇自身强大的迁徙能力以及气流扩散等因素相关[28]。除桂林永福地理种群外，大多数种群并未与同一地理种群聚类，大部分种群间保持中高度FST值和Nm值，这种长距离种群间的传播可能与不同地区之间的种苗调运有关[12]。广西水果种植面积迅速扩增，水果在各种植区相互调运，促使橘小实蝇在不同地域相互侵染，呈现出不同地区COI序列在各地理种群间混杂的现象。
私有单倍型的出现，是生物适宜环境的结果，可减少物种间基因交流的影响，从而保持稳定的种群遗传多样性[19，28]。本研究检测到不同地理种群橘小实蝇的单倍型中私有单倍型较共享单倍型更多，对于同一单倍型在地理距离相距较远的种群之间共享的现象，推测可能源于种群间的基因交流或原始单倍型多态性的保留。单倍型Hap1在大部分地理种群中均有分布且出现频率最高，并位于星状图中央，由此推测单倍型Hap1为橘小实蝇群体中广泛分布的高适应性的祖先单倍型[22]。
样品数量可能对遗传分化系数及基因流的统计存在一定影响。本研究取样点分布范围广，具有一定地区代表性，为更好地明确广西橘小实蝇的来源及扩散路径，后续研究可以考虑增加不同地理种群的样本量或基因数目，并且联合广西周边省份的橘小实蝇样本进一步深入分析。
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