王瑞雪，房一明，郭娜，姚晶，张筠，初众
1. 黑龙江东方学院食品工程学院（哈尔滨市 150066）；
2. 中国热带农业科学院香料饮料研究所（万宁市 571533）
糖尿病是由于胰岛素分泌不足而引发的代谢紊乱疾病，主要分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅱ型糖尿病患者占多数[1-2]。胰岛β细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要成因，胰岛素抵抗主要表现为肝脏及其外周组织对葡萄糖的摄取和利用能力下降[3-5]。建立细胞模型是一种在体外探究物质功能性的试验手段，HepG2细胞与正常肝细胞功能相近，在高浓度胰岛素作用下，其表面的胰岛素受体减少，较易产生胰岛素抵抗，故此，用高浓度的胰岛素诱导建立的IRHepG2模型是筛选改善胰岛素抵抗成分的理想细胞模型[6-11]。
柠檬（Citrus limon）属芸香科柑橘属，柠檬果皮占整个柠檬的20%左右，是柠檬加工的主要副产物[12]。其果皮富含精油、果胶、酚酸、类黄酮等活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗菌和降血糖等作用[13-16]。试验首先探究IR-HepG2细胞模型的最佳建立方法，其次来研究柠檬皮多酚对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响，以期为进一步研究柠檬皮多酚的降血糖功能奠定试验基础。
1.1 材料与试剂
HepG2细胞株、DMEM高糖培养基、PBS、0.25%EDTA-胰酶、青-链霉素（苏州美仑生物科技有限公司）；
胎牛血清（哈尔滨市立峰生物工程有限公司）；
盐酸二甲双胍、MTT、DMSO（北京博奥拓达科技有限公司）；
胰岛素（Beyotime公司）；
葡萄糖检测试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）；
纯度68%柠檬皮多酚（实验室自制）。
1.2 仪器与设备
150iCO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；
TS2-FL倒置显微镜（日本Nikon公司）；
SW-CJ-2FD超净工作台（上海博迅生物仪器股份有限公司）；
80-2离心机（上海浦东物理光学仪器厂）；
RT-6000酶标分析仪（深圳雷社生命科学股份有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 细胞培养
结合Seyfizadeh等[17]和马萍等[18]的方法，将冻存的HepG2细胞于37 ℃水浴中1 min内快速解冻，于89%DMEM∶10%胎牛血清∶1%青-链霉素的培养基和37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养，2～4 d按1∶3传代。
1.3.2 不同浓度胰岛素对HepG2细胞存活率的影响
参考隋淼等[19]的方法稍作修改，设立空白组（不含细胞）、对照组（含细胞不加胰岛素）和模型组（含细胞和不同浓度胰岛素），将HepG2细胞消化后，吹打均匀，以每孔2×104个细胞铺于96孔板，培养过夜，模型组分别加入胰岛素浓度为1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8和1×10-9mol/L的DMEM培养液，100 μL/孔，于37 ℃培养24 h后，根据MTT法[20]，加入5 mg/mL MTT溶液（10 μL/孔），4 h后移除培养液，加入DMSO（150 μL/孔），充分振荡，酶标仪492 nm测定吸光度，根据式（1）计算细胞存活率。
1.3.3 胰岛素抵抗模型的建立
1.3.3.1 胰岛素最佳作用浓度和时间的确定
参考王梦等[21]的方法稍作修改，设立空白对照组（不含胰岛素）和胰岛素组（分别加入胰岛素终浓度为1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8和1×10-9mol/L的培养基），HepG2细胞铺板同1.3.2小节，培养过夜，弃去旧液，加入各浓度胰岛素培养液，100 μL/孔，培养48 h，每12 h用葡萄糖检测试剂盒测定一次葡萄糖消耗量（方法参照试剂盒说明书），按式（2）、（3）计算葡萄糖消耗量和消耗率。
式中：Δm为葡萄糖消耗量，mmol/L；
M为葡萄糖消耗率，%；
n为空白对照组葡萄糖消耗量，mmol/L；
m为模型组葡萄糖消耗量，mmol/L。
1.3.3.2 IR-HepG2模型稳定性的测定
用1.3.3.1小节中的最佳建模方案建模后，弃去旧液，更换为正常培养液，继续培养72 h，每隔24 h测定一次葡萄糖消耗量（方法同1.3.3.1小节）。
1.3.4 IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量及存活率的测定
结合符群等[22]和齐佳等[23]的方法稍作修改，以1.3.3小节中最佳建模方案建模，设空白对照组和0.05mg/mL二甲双胍阳性对照组以及LPP样品组，LPP终质量浓度分别为2.5，2，1.5，1，0.5和0.1 mg/mL，分别培养24，48和72 h，测定LPP干预后IR-HepG2细胞存活率（方法同1.3.2小节）及其培养液中葡萄糖的含量（方法同1.3.3小节），探究不同浓度的柠檬皮多酚对IR-HepG2细胞存活率和葡萄糖消耗量的影响。
1.4 数据处理
数据采用Origin 2019b、SPSS 17.0进行绘图及数据分析，以Duncans’法进行组间差异显著性分析。
2.1 不同浓度胰岛素对HepG2细胞存活率的影响
通过测定24 h时各组细胞在不同剂量胰岛素作用后的细胞存活率来判断用胰岛素建模的安全用药浓度。
由表1可知，除1×10-8mol/L的胰岛素组外，其余浓度的胰岛素组，随胰岛素浓度增加，吸光度减小，1×10-8mol/L的胰岛素可能对细胞生长具有促进作用。胰岛素浓度在1×10-5～1×10-9mol/L浓度范围内时，细胞存活率均在80%以上，对细胞基本无毒副作用，因此后续建模安全给药浓度可以设置在1×10-5～1×10-9mol/L范围内[24]。
表1 不同浓度的胰岛素对HepG2细胞存活率的影响（n=5）
2.2 建立胰岛素抵抗模型
2.2.1 确定最佳浓度和作用时间
经过对比空白对照组和样品组在各时间段的葡萄糖消耗量，来判断IR-HepG2细胞模型的最佳建模方案。
由图1可知，在0～12 h与对照组相比胰岛素组的葡萄糖消耗量除了胰岛素浓度为1×10-8mol/L组以外差异均不明显，在细胞培养的前12 h内，HepG2细胞摄取葡萄糖的能力良好，未出现胰岛素抵抗的现象。在细胞培养到24 h时，部分浓度下的HepG2细胞葡萄糖摄取和利用能力出现异常，当胰岛素浓度为1×10-5mol/L和1×10-6mol/L时，葡萄糖消耗量相比前12 h有所下降，仅为1.81±0.05 mmol/L和1.84±0.11 mmol/L，与对照组相比葡萄糖消耗量分别减少了34.4%和33.3%，差异显著（P＜0.05），此时可以判断HepG2细胞出现了糖代谢紊乱现象，且这两组的葡萄糖消耗量在12～48 h内均显著（P＜0.05）低于对照组，在24 h时抵抗状态最为明显。结合1.3.4的细胞存活率，最终确定培养液中胰岛素的浓度为1×10-6mol/L培养24 h为最佳建模方案。该结果与刘志霞等[25]建立IR-HepG2模型时所用的胰岛素添加量和诱导时间相吻合。
图1 不同浓度胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响（n=5）
2.2.2 IR-HepG2模型稳定性评估
培养液胰岛素浓度1×10-6mol/L作用24 h后IRHepG2细胞更换为正常培养基中每隔24 h测定葡萄糖消耗量，结果见表2。
表2 IR-HepG2细胞模型去负荷后不同时间点的葡萄糖消耗量（n=5） 单位：mmol/L
由表2可知，与对照组相比，胰岛素组在24～72 h内HepG2细胞的葡萄糖消耗量更低，具有显著性差异（P＜0.05），因此本方法建立的IR-HepG2细胞模型可持续72 h。
2.3 柠檬皮多酚对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量及存活率的影响
用0.1～2.5 mg/mL的LPP分别作用于IR-HepG2细胞24，48和72 h，测定葡萄糖含量及细胞存活率。如图2～图3。
图2 柠檬皮多酚对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响（n=5）
图3 LPP对IR-HepG2细胞存活率的影响（n=5）
由图2可知，各组葡萄糖消耗量随时间的增加逐渐降低，出现这个趋势的原因极可能是与细胞活性有关，随着培养时间增加，细胞存活率逐渐下降，利用葡萄糖的能力有所下降[26]。模型组的葡萄糖消耗量在各时间段均显著低于空白对照组，说明细胞出现了葡萄糖代谢异常[27]。与模型组相比，阳性对照组和LPP浓度为0.1～2 mg/mL时的葡萄糖消耗量在各时间段均显著（P＜0.05）高于模型组，且在LPP浓度为0.5 mg/mL时葡萄糖消耗量整体达到了峰值，在24 h时最高（4.78±0.13 mmol/L），比模型组的葡萄糖消耗率高了15.1%。与阳性对照组相比，在LPP质量浓度为0.1～1 mg/mL时各时段的葡萄糖消耗量与阳性对照组差异不显著（P＞0.05），说明LPP在这个浓度范围内与0.05 mg/ml的二甲双胍改善胰岛素抵抗的能力相近。与王梦丽[28]研究的荚蒾果多酚相比，LPP在相同剂量（0.05 mg/mL）和培养时间（24 h）下对葡萄糖的消耗量比荚蒾果多酚多了1.29 mmol/L，相比之下LPP改善胰岛素抵抗的效果更好。
评价LPP缓解胰岛素抵抗时，对IR-HepG2细胞活性的影响，以确保对细胞的安全性。测定LPP在不同浓度和时间下，对IR-HepG2细胞存活率的影响，如图3。
从图3中可以看出，相较空白对照组，各组细胞存活率均在80%以上，且样品组随着LPP浓度的降低细胞存活率上升，呈现剂量依赖性，说明高浓度的LPP对IR-HepG2细胞存活率有一定的抑制作用[29]。整体趋势表明24 h时细胞存活率高于其他时间组，72 h时细胞存活率最低。可判定24 h可作为LPP改善胰岛素抵抗干预的最佳时间[30]。
文章以 HepG2细胞为载体，通过建立最佳的IRHepG2细胞模型，探究柠檬皮多酚对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响。研究发现当培养液中胰岛素浓度为1×10-6mol/L培养24 h时可以建立效果最佳的IRHepG2细胞模型。当柠檬皮多酚质量浓度在0.1～2 mg/mL时可以明显提高IR-HepG2细胞对葡萄糖的摄取和利用，但是对于其作用机制还不清楚，因此还需继续深入探究其作用机制，为柠檬皮多酚在食品、生物医药等领域的运用提供理论依据。
猜你喜欢 培养液消耗量存活率 路基石方爆破降低炸药消耗量研究西部交通科技(2022年2期)2022-04-27日本癌症10年平均存活率为57.2%，胰腺癌最低仅5.3%祝您健康(2020年5期)2020-05-14几种培养液对水螅种群增长影响探究绿色科技(2019年18期)2019-11-222018双积分核算情况公布 去年新能源汽车正积分超四百万分新能源汽车报(2019年25期)2019-08-13新能源汽车正积分近百万分新能源汽车报(2018年9期)2018-05-14有机化学反应中试剂最大消耗量问题探析中学生数理化·高二版(2016年3期)2016-12-26刍议“探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化”实验的教学建议中学教学参考·理科版(2016年5期)2016-05-14超级培养液科学启蒙(2015年8期)2015-08-07植物栽培温室大棚养殖林蛙试验河北渔业(2015年1期)2015-01-19温度对克氏原螯虾苗种生长和存活的影响河北渔业(2015年1期)2015-01-19