【摘要】 目的 通过检测BMP-4在下颌骨发育异常导致的骨性II类错牙合畸形患者和颌骨健康发育的正常牙合志愿者不同发育阶段血液中的表达情况，以探究BMP-4的表达量与下颌骨生长量的关系。方法 将年龄为10-14周岁的患者设为发育高峰组A组，年龄＞17周岁患者设为成年组B组。各组又分为骨性Ⅰ类对照组和骨性Ⅱ类错牙合组，共计4组68人。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western-blot）法，分别检测各实验组患者血液中的BMP-4mRNA的表达量。结果 ①发育高峰组A组：RT-PCR检测结果显示，骨性Ⅰ类错牙合畸形组中BMP-4mRNA的表达量是：1.14±0.36μg∕μl，骨性Ⅱ类错牙合畸形组中BMP-4mRNA的表达量是0.43±0.27μg∕μl，与对照组骨性Ⅰ类组比较P＜0.05。②成年组B组：RT-PCR检测结果显示，骨性Ⅰ类错牙合畸形组中BMP-4mRNA的表达量是：1.08±0.33μg∕μl，骨性Ⅱ类错牙合畸形组中BMP-4mRNA的表达量是0.79±0.225μg∕μl，BMP-4mRNA在骨性Ⅱ类与骨性Ⅰ类两组中的表达量比较无明差异不典型（P＞0.05）。③Western-blot检测结果与RT-PCR检测结果一致。结论 ①在下颌骨发育的高峰期，下颌发育不足与BMP-4表达的降低有一定关系。②在下颌骨成熟期，BMP-4表达量的降低可能对下颌骨的生长影响不大。
【关键词】 骨性Ⅱ类错牙合畸形；BMP-4；下颌骨；基因调控
下颌骨的发生受到神经脊细胞周围微环境信号基因调控［5］。其中髁状突的发生与下颌骨的生长密切相关，髁状突软骨的改建在一定程度上影响着下颌骨的改建，它的生长不仅受到全身因素的调节，而且局部生长因子的反馈作用在其中也占据重要地位［6］，其调节过程较为复杂。有研究证实，BMP-4可能是调控下颌骨发育的重要基因之一［7-9］。1 对象与方法
1.1 研究对象 研究对象为我院正畸科2010年-2011年因骨性错牙合畸形前来矫治的患者，无口腔不良习惯及替牙期障碍，无颌面部损伤史、无营养不良，无全身重大疾病以及其他遗传病史。选定72例，其中发育高峰组A组（10-14周岁）36例，成年组B组（年龄＞17周岁）36例。A、B组又分为骨性Ⅱ、Ⅲ类实验组各17例。选取颌骨发育及咬合关系正常的志愿者36例作为对照组，其中发育高峰期志愿者17例，成年志愿者17例。
1.2 研究对象样本分组 实验总计4组，即发育高峰组骨性Ⅰ、Ⅱ类分别记作A1A2、成年组骨性Ⅰ、Ⅱ类分别记作B1B2，采取各组静脉血液样本，具体分组，见表1。
表1 实验样本分组情况
骨性Ⅰ类（对照） 骨性Ⅱ类（实验）
发育高峰组A（10-14周岁） A1(17例) A2(17例)
成年组B（大于17周岁） B1(17例) B2(17例)
1.3 总RNA提取 离心柱型全血总RNA提取试剂盒提取总RNA，在NanoDrop 2000C分光光度计（Thermo Scientific，上海）下检测所提取的总RNA纯度。
1.4 血液总RNA纯度的检测
1.4.1 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度 根据测得的RNA浓度计算1μgRNA用于琼脂糖凝胶电泳的量，取5-8μl的RNA样品用于1%琼脂糖凝胶电以检测RNA提取的情况。经过琼脂糖凝胶电泳成像分析，如果含有2-3条清晰目的条带，无拖尾、弥散等现象，说明RNA提取质量尚可。
1.4.2 分光光度计检测总RNA纯度 在NanoDrop 2000C分光光度计（Thermo Scientific，上海）下，检测总RNA吸光度值A260与A280的比值，A260/A280值处于1.6-1.9之间，说明所提取的总RNA纯度良好，可用于后续实验。
1.5 血液总RNA逆转录合成cDNA
1.5.1 引物合成 根据Genebank提供的信息，引物由上海生工生物工程有限公司代理合成完成，设计人BMP-4基因（Genebank：序列号GI：34179723）及人β-actin基因（Genebank：序列号NM＿001101.3）引物，具体情况，见表2。
表2 引物基本情况
基因 产物大
小（bp） 引物序列 退火温度
（℃） PCR
循环
BMP-4 282 5-TCCATGCTGTACCTGGATGA-3
5-TGAGTGGATGGGAACGTGT-3 53 30
β-actin 353 5-GCTSGTCGTCGACAACGGCTC-3
5-CAAACATGATCTGGGTCATCTTYTC-3 54 20
1.6 实验数据分析 RT-PCR同时测定目的基因人BMP-4和内参照β-actin，计算出各个样本原始的模板数。根据比较阈值法，来计算各个基因的mRNA表达的相对比例。采用SPSS16.0对数据进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。2 结 果
2.1 RNA质量检测
2.1.1 NanoDrop 2000C分光光度计检测RNA纯度（随机抽取两份），见表3。
表3 紫外分析检测结果
Sample OD260 OD280 OD260∕OD280 Nucleic Acid
Conc(μg∕μl) Result
样品a 0.295 0.158 1.870 1173 合格
样品b 0.215 0.119 1.812 1050 合格
2.2 BMP-4mRNA在各实验组的表达
2.2.1 Real-time PCR结果 发育高峰错牙合组（A）：骨性Ⅱ类组中BMP-4mRNA的表达量低于骨性Ⅰ类组，有统计学差异（P＜0.05）；成年错牙合组（B）：骨性Ⅱ类组中BMP-4蛋白的表达量低于骨性Ⅰ类组（P＞0.05），结果，见表4、表5。
表4 发育高峰错牙合组（10-14岁）及成年错牙合组（＞17岁）统计结果
组别 发育高峰错牙合组BMP-
4mRNA表达量（ng/μl） 成年错牙合组BMP-
4mRNA表达量（ng/μl）
骨性Ⅰ类组 1.14±0.36 1.08±0.33
骨性II类组 0.43±0.27√ 0.79±0.225
“√”表示与对照组比较，有统计学意义。
表5 发育高峰错牙合组（10-14岁）及成年错牙合组（＞17岁）
血清BMP-4水平
组别 发育高峰错牙合组血
清BMP-4水平（ng/l） 成年错牙合组血
清BMP-4水平（ng/l）
骨性Ⅰ类组 1.210±0.10 1.157±0.14
骨性II类组 0.806±0.11 1.080±0.11
3 讨 论
下颌骨发育异常是骨性错牙合畸形发生的重要机制，是遗传因素占主导地位的多基因遗传疾病［1，2，3，4］。Ricardo Machado Cruz等对来自55个家庭的2562人通过横向cephalograms，照片，牙齿模型证实一个重要基因影响了具有明显孟德尔氏遗传迹象的下颌前突的表达，并且这个基因是影响下颌前突多因素中的重要组成部分［10］。陈允嘉等［11］对Ⅱ类2分类错牙合家庭聚集性及遗传度的调查研究表明：Ⅱ类2分类错牙合畸形的发生具有典型的家族遗传倾向。BMP-4作为影响全身多系统、多器官发育、生长的重要基因，在多种遗传性疾病中，研究者均检测到了BMP-4的表达异常。本研究以下颌骨发育异常的遗传性倾向为出发点，检测BMP-4基因在下颌骨发育各个阶段因发育异常导致的各类错牙合畸形的表达情况。下颌骨的发生受到神经脊细胞周围微环境信号基因调控［5］。其中髁状突的发生与下颌骨的生长密切相关，髁状突软骨的改建在一定程度上影响着下颌骨的改建，它的生长不仅受到全身因素的调节，而且局部生长因子的反馈作用在其中也占据重要地位［6］。
RT-PCR与WB检测结果均显示：在成年组（B），BMP-4mRNA的表达量在骨性Ⅱ类错合组和骨性Ⅰ类错牙合组中并不具有明显的统计学差异（P＞0.05）。在发育高峰错牙合组（A），骨性Ⅱ类组中BMP-4蛋白的表达量低于骨性Ⅰ类组，有统计学差异（P＜0.05）。推测BMP-4对下颌骨的生长发育整个过程有明显的促进作用，在下颌骨的发育过程中BMP-4mRNA的表达量越高，下颌骨的生长量越大，可能是BMP-4与其受体复合物通过激活相关Smad蛋白的形式来实现胞内信号的传递［8］，也可能是BMP-4与受体结合后，导致细胞膜表面电荷重新分布，使其向骨细胞方向分化［12］等方式促进下颌骨发育。吕红兵等［13］通过降低小鼠胚胎早期面突组织中BMPs的表达，结果实验组的小鼠均有不同程度的腭裂形成。推测BMP-4在胚胎发育早期对下颌骨的生长发育都有着至关重要的作用，在面部组织发育早期BMP-4表达的降低和缺失会造成颌骨、牙及其它组织的发育不全及缺失，但在发育末期，BMP-4的高表达对下颌骨的生长发育有促进作用，BMP-4表达的降低对下颌骨的生长发育基本不会造成影响。具体机制尚需进一步研究探讨。
本研究的结果证实BMP-4对人下颌骨的生长具有促进作用，但在下颌骨稳定后BMP-4表达的降低并不是引起下颌骨发育不足的唯一因素，可能有其它因素共同参与了调节，具体的调节机制尚待探究。本研究为具有遗传史的骨性Ⅱ类错牙合畸形患者的诊断寻找新的途径，认为BMP-4基因在生长发育的高峰期可以作为诊断骨性Ⅱ类错牙合畸形的基因之一，但在下颌骨发育趋于稳定后其只能作为参考基因，不能作为诊断基因。
参考文献
［1］ Z Laeon.Insulin-like growth factor 1（BMP-4）：a growth hormone［J］.Mol Path，2001，54：311-316.
［2］ Petrovic AG.Mechanisims and regulation of mandibular condylar growth.［J］Acta morphologica Neerlando-Scandinavica.1972，10(1)：25-34.
［3］ Urist M R，Lietze A，Mizutani H，et al.A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein(BMP) fraction［J］.Clin Orthop，1982(162)：219-232.
［4］ Ozkaynake，Rueger DC，Drier EA，et al.OP-1 cDNA encodes an osteogenic p rotein in the TGF-β family［J］.EMBOJ，1990，9(7)：2085-2093.
［5］ ［Cruz RM，Krieger H，Ferreira R，Mah J，Hartsfield J Jr，Oliveira S.2008.Major gene and multifactorial inheritance of mandibular prognathism.Am J Med Genet Part A 146A：71–77.
［6］ Liu W，Selever J，Murali D，Sun X，Brugger SM，Ma L.Threshold-specific requirements for BMP4 in mandibular development.Dev Biol，2005 Jul 15，283(2)：282-93.
［7］ BENNETT J H，HUNT P，THOROGOOD P.Bone morphogenetic protrin-2 and 4 expression during murine orofacial development［J］.Arch Oral Biol，1995，40：847.
［8］ 吕红兵，金岩，李鑫.骨形成蛋白mRNA的表达与腭裂形成之间的关系［J］.第四军医大学学报，1999，20(2)：124.
［9］ VuKicevic S，Latin V，Chen P，etal.Biolchern Biolphys Res Commun，1994，198：693.
［10］ 罗应伟，李松，沈丽宁，BMP4mRNA在Meckel’s软骨中的表达及意义，昆明医学院口腔学院，昆明650031.
［11］ 陈允嘉，等.安氏Ⅱ-2类错牙合家庭聚集性与遗传度研究［J］.重庆医学，2011.3.
［12］ Cruz RM，Krieger H，Ferreira R，Mah J，Hartsfield J Jr，Oliveira S.2008.Major gene and multifactorial inheritance of mandibular prognathism.Am J Med Genet Part A 146A：71–77.
［13］ 罗应伟，李松，沈丽宁.BMP4mRNA在Meckel’s软骨中的表达及意义，昆明医学院口腔学院，昆明650031