[摘要]目的 探讨Bcl-2，Bax及Caspase-9在子宫内膜异位症（Endometrosis，EMS）患者异位内膜中和在位内膜中的表达及其意义。方法 采用Western Blot法检测Bcl-2，Bax及Caspase-9蛋白在EMS患者异位及在位内膜组织中的半定量表达情况。结果 Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白在EMS患者在位内膜的相对半定量表达值分别为0.5189±0.5176、0.4676±0.2346和0.2873±0.1018，而在异位内膜中分别为0.7348±0.4372、0.2327±0.2417和0.1447±0.1209。异位内膜中的Bcl-2蛋白的表达高于在位内膜，而Bax及Caspase-9蛋白低于在位内膜，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论 与在位内膜相比，EMS患者的异位内膜中的Bcl-2蛋白的表达升高，而Bax及Caspase-9蛋白表达降低，细胞凋亡能力减弱，可能是致使异位的子宫内膜组织在异位种植生长，导致EMS发生发展的机制之一。
[关键词] 子宫内膜异位症；Bcl-2；Bax；Caspase-9；细胞凋亡
[中图分类号] R711.71 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）33-01-02
The Expression and Its Significance of Bcl-2，Bax and Caspase-9 in Patients with Endometrosis
WANG Yuanxiang
Rudong County People"s Hospital of Jiangsu Province，Rudong 226400，China
[Abstract] Objective To discuss the expression and significance of Bcl-2，Bax and Caspase-9 at ectopic endometrium and in ectopic in patients with endometrosis. Methods The semiquantitative expression of Bcl-2，Bax and Caspase-9 at ectopic endometrium and in ectopic in patients with endometrosis were detected by Western Blot. Results The semiquantitative expression of Bcl-2，Bax and Caspase-9 at inectopic in patients with endometrosis were 0.5189±0.5176，0.4676±0.2346 and 0.2873±0.1018 respectively. while 0.7348±0.4372，0.2327±0.2417 and 0.1447±0.1209 at ectopic endometrium. The expression of Bcl-2 at ectopic endometrium was higher than the inectopic ones; while the expression of Bax and Caspase-9 at ectopic endometrium was lower than the inectopicones，and there were statistically significance（P＜0.05）. Conclusion Compared with the inectopic endometrium，the expression of Bcl-2 was higher while the expression of Bax and Caspase-9 were lower，which indicated that the ability of cell apoptosis decreased，and which caused ectopic endometrium organizations growing in ectopic place，and may be one of the mechanism which leading to the occurrence and development of endometrosis.
[Key words] Endometrosis；Bcl-2；Bax；Caspase-9；cell apoptosis
子宫内膜异位症（endometrosis，EMS）是生育年龄妇女常见疾病之一，发病率为10%～15%[1]。EMS是良性激素依赖性疾病，具有类似恶性肿瘤远处转移和种植生长的能力，在患者不孕症中约40%由EMS所致[2]。EMS目前发病机制仍不明确，治疗效果也不甚理想，探讨EMS发病机制一直是妇科研究领域的热点。近年来研究发现细胞凋亡在EMS的发病过程中起重要作用，本研究探讨了Bcl-2，Bax及Caspase-9在EMS患者异位内膜中和在位内膜的表达情况及其表达的意义。
1 资料与方法
1.1 标本收集
收集2008年1月～2011年1月我院妇产科行手术治疗的32例EMS患者异位内膜中和在位内膜标本，术后均经病理学证实为EMS，所有的子宫内膜都处于增生期，仅少部分标本夹杂有分泌期改变。中位年龄33岁（29～36岁），手术前3个月均无特殊药物治疗。
1.2 实验材料
Bcl-2、Bax及Caspase-9一抗为多克隆山羊抗人抗体，二抗为HRP 标记的兔抗山羊多克隆抗体，内参为HRP 标记的单克隆鼠抗人β-action抗体，Marker为预染蛋白Marker，均为美国Santa Cruz公司产品。RAPA裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒及ECL 化学发光试剂盒均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。
1.3 Western Blot测定
所有新鲜标本取下后立即置EP管放入液氮罐中保存。用眼科剪将组织标本尽量剪碎，用RAPA 裂解液裂解组织，提取总蛋白，用BCA 法测每一组的蛋白浓度，制备12% SDS-PAGE，上样量为100 μg总蛋白/泳道，进行电泳，经干法转印到PVDF膜上（Amresco 公司，美国），室温下用5% BSA-TBST封闭1h，分别加入Bcl-2、Bax及Caspase-9兔抗人多克隆抗体（1∶50 稀释）及GAPDH兔抗人单克隆抗体（1∶1000 稀释），4℃孵育过夜，然后加入HRP 标记的山羊抗兔IgG（1∶8000 稀释），室温下孵育3h，TBST 洗涤，加入发光剂ECL自显影。Bcl-2、Bax及Caspase-9相对含量用Bcl-2或Bax或Caspase-9/β-action灰度比值表示（灰度用Gel-Pro Analyzer 分析）。每组重复3 次。
1.4 统计学处理
应用SPSS 13.0 统计分析软件分析实验数据，其中计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，计量资料进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
Western-blot 免疫印迹结果显示，EMS患者异位内膜中和在位内膜可检测到Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白的表达（图1）。以β-action作为内参照，Bcl-2或Bax或Caspase-9/β-action的灰度比值分别代表Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白的相对半定量表达。如表1所示，Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白在EMS患者在位内膜相对半定量的表达值分别为0.5116±0.0071、0.4497±0.0166和0.2488±0.0370，而异位内膜中分别为0.7306±0.0175、0.2352±0.0051和0.1432±0.0017。在位内膜中Bcl-2蛋白的表达低于异位内膜中，而Bax及Caspase-9蛋白高于异位内膜中，差异均具有统计学的意义（P＜0.01）。
1～3 异位内膜中；4～6 在位内膜
3 讨论
1860年，Roktanskv在尸体解剖中首次发现EMS，随着诊断水平的提高，EMS已成为生育年龄妇女的常见病，发病率为10%～15%[1]，在妇科疾病中其发病率仅次于子宫肌瘤[3]，在患者不孕症中约40%由EMS所致[2]。EMS是良性激素依赖性疾病，具有类似恶性肿瘤远处转移和种植生长的能力。140年来科学家一直致力于EMS发病机制的研究，但目前发病机制仍不明确，治疗效果也一直不甚理想，探讨EMS发病机制一直是妇科研究领域的热点。
近年来研究发现细胞凋亡在EMS的发病过程中起重要作用。Bcl-2基因家族是公认的参与细胞凋亡调控的重要基因，Bcl-2和Bax是家族中最重要的一对正负凋亡调控因子。Bcl-2被称为“凋亡抑制基因”，过度表达可通过抑制程序性细胞死亡来阻碍或延迟正常细胞的分化，从而延长细胞的寿命；Bax是促凋亡基因，可以自身形成同源二聚体诱导凋亡[4]。正常子宫内膜Bcl-2与Bax表达具有一定周期性，Konno等[5]研究发现Bcl-2在正常子宫内膜月经周期增生期腺细胞和晚期分泌期腺细胞中的表达情况不同，Bcl-2在前者有较强的表达，而在后者无表达；Bcl-2表达增殖期高于分泌期，Bax表达分泌期高于增殖期，正是Bcl-2与Bax表达的周期性维持了月经周期的规律性。国内外研究显示，Bcl-2在EMS患者与正常妇女原始卵泡中的表达量不同，Bcl-2在前者的表达显著升高[2]；而Bcl-2在EMS卵巢异位内膜中、在位内膜及正常子宫内膜的表达也不同，其在EMS卵巢异位内膜中的表达显著增强[6]。
本研究结果显示，与在位内膜相比，EMS患者异位内膜中Bcl-2表达升高，而Bax表达减弱，Bcl-2/Bax比值上升，提示异位内膜中细胞凋亡减弱，增殖能力增强。这样的内膜细胞抗凋亡能力明显增强，破坏了细胞增殖和凋亡的平衡，容易异位于盆腹腔或腹壁切口种植生长及不断发展，支持“在位内膜决定论”。异位子宫内膜Bcl-2和Bax表达异常可能参与了EMS子宫内膜凋亡特性的改变，对EMS的发生和发展起到一定的作用。
细胞凋亡机制的研究中提出两条主要信号途径，即线粒体途径和死亡受体途径[7]。Caspases是凋亡信号转导的共同通路，许多调控细胞凋亡的因素都通过caspases酶系起作用。在凋亡的线粒体途径中，Caspase-9位于Caspae级联反应的上游，是最重要的起始因子，也是关键蛋白酶。Caspase-9活化从而激活效应Caspase-3而导致细胞凋亡。本研究结果显示，与在位内膜相比，EMS患者异位内膜中Caspase-9表达减弱，进一步验证了异位内膜中细胞凋亡能力减弱，并且可能是通过抑制线粒体途径诱导的细胞凋亡而实现[8]。
综上所述，与在位内膜相比，EMS患者的异位内膜中Bcl-2蛋白的表达降低，而Bax及Caspase-9蛋白表达升高，细胞凋亡能力减弱，可能是致使异位的子宫内膜组织在异位种植生长，导致EMS发生发展的机制之一。但受样本例数的限制，有待扩大样本量进一步研究。
[参考文献]
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[3] Gianetto-BerruttiA，FeylesV. Endometriosis related to infertility[J]. MinervaGinecol，2003，55（5）：407-416.
[4] Malla R，Gopinath S，Alapati K，et al. Downregulation of uPAR and cathepsin B induces apoptosis via regulation of Bcl-2 and Bax and inhibition of the PI3K/Akt pathway in gliomas[J]. PLoS One，2010，5（10）：e13731.
[5] Konno R，Yamakawa H，Utsunolmiya H，et al. Expression of survivin and Bcl-2 in normal human endometrium[J]. Mol Hum Reprod，2000，6（6）：529-534.
[6] 于静，王化丽，王长智. Bcl-2蛋白在子宫内膜异位症的表达及意义[J].中国妇幼保健. 2004，19（3）： 34-36.
[7] Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis[J].Nature，2000，407（6805）：770-776.
[8] 史呋香. 子宫内膜异位症60例临床观察[J]. 临床合理用药杂志，2010，3（8）：59-60.
（收稿日期：2011-09-16）
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