注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素方法验证
[摘要] 目的 对注射用盐酸吉西他滨的细菌内毒素检查方法进行探讨，建立其细菌内毒素检查方法。 方法 按《中国药典》2010版附录Ⅺ E细菌内毒素检查方法进行。 结果 在验证条件下，注射用盐酸吉西他滨可以采用稀释方法排除干扰。 结论 可以采用此法对本品的细菌内毒素进行检查。
[关键词] 注射用盐酸吉西他滨；细菌内毒素方法；验证
[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）01-123-03
盐酸吉西他滨（gemcitabine hydrochloride）化学名2-脱氧-2，2-盐酸二氟脱氧胞苷（β-异构体），是一种阿糖胞苷类似物，由美国礼来公司研发的核苷类抗代谢抗癌药[1]。属于新型抗嘧啶核苷酸代谢化疗药物，属细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，即S期细胞。在一定条件下，可以阻止G1期向S期的进展；具有抗瘤谱广、作用机制独特、毒性反应低、与其他化疗药物无交叉耐药且毒性反应无叠加等特点。在过去的临床工作中，我们观察到盐酸吉西他滨是疗效较好而毒副反应较少的化疗药物之一[2-3]。无菌检查、细菌内毒素、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目[4]，本品为冻干粉针按照中国药典2010版附录ⅠB[5]的要求，要进行细菌内毒素检查。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 Ms3digital旋涡混合器，CJ-2F净化工作台，DK-600S电热恒温水槽，DMH-1电热干燥箱。
1.1.2 试剂 鲎试剂1[规格0.06EU/mL（0.1mL/支），批号10090612]福州新北生化工业有限公司；鲎试剂2[规格0.06EU/mL（0.1mL/支），批号1102111]湛江安度斯生物有限公司；鲎试验用水（50mL/支，批号10010515）福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素工作标准品（规格180EU/支，批号150601-200965）中国药品生物制品检定所；pH调节剂（规格2mL/支，批号100904）福州新北生化工业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 试验准备 所有容器、用具都必须经过处理，去除外源性内毒素，玻璃仪器于250℃干烤至少1h，塑料用具须确证不干扰实验结果；操作过程中避免微生物污染；初次使用的鲎试剂必须经过灵敏度复核[5]。参照盐酸吉西他滨的细菌内毒素限值，注射用盐酸吉西他滨（0.4g）的细菌内毒素限值定为：按吉西他滨计L≤0.03EU/mg。
1.2.2 鲎试剂灵敏度复核 按《中国药典》2010版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂的标示灵敏度复核。两批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查λc与λ一致（应在0.5λ≤λc≤2λ范围内），结果均符合规定。
1.2.3 注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素检查干扰试验[5]
1.2.3.1 干扰预试验（鲎试剂：λ=0.06EU/mL） 取本品，加鲎试验用水（BET水）进行供试品溶液（NPC）和供试品阳性对照溶液（PPC）的配制。（1）供试品溶液（NPC）配制：取三个批号的供试品，分别用用鲎试验用水10mL充分振摇使溶解。制备成10、5.0、2.5、1.2、0.625mg/mL五个浓度，并用pH调节剂调节pH值至6～8。（2）细菌内毒素工作标准品溶液稀释方法：用1mL的鲎试验用水溶解1支细菌内毒素工作标准品，用旋涡混合器连续混合15min，成180EU/mL，用BET水稀释成4λ、2λ，进行下一步稀释前，至少混和30s。（3）供试品阳性对照溶液（PPC）的配制：配制的浓度同NPC，每个浓度中含2λ（0.125EU/mL）的细菌内毒素。制备成10mg/mL+2λ、5.0mg/mL+2λ、2.5mg/mL+2λ、1.25mg/mL+2λ、0.625mg/mL+2λ五个浓度。（4）试验过程：取上述二个厂家的鲎试剂各64支，先分别加入0.1mL BET水溶解，再分别加入0.1mL供试品和供试品阳性各浓度稀释液，混匀后，于（37±1）℃无振动保温（60±2）min，同时设阴性和阳性对照，每个浓度平行做2管。
通过上表的结果表明，注射用盐酸吉西他滨在吉西他滨浓度为5.0mg/mL以下时，对以上二个厂家的鲎试剂均未产生干扰作用。故含吉西他滨5.0mg/mL稀释液为最大有效活性浓度。实验浓度选择含吉西他滨为2.5mg/mL的稀释液。
1.2.3.2 供试品的干扰试验 为进一步确证供试品溶液对0.06EU/mL的鲎试剂是否存在干扰作用，分别用BET水和供试品2.5mg/mL稀释液进行实验，将细菌内毒素工作标准品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的系列内毒素溶液。（1）供试品2.5mg/mL稀释液的制备：取上述三个批号的供试品，分别用BET水稀释成含吉西他滨2.5mg/mL的供试液。（2）试验过程（鲎试剂：λ=0.06EU/mL）：用BET水与2.5mg/mL供试液分别将细菌内毒素工作标准品稀释成0.125EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL、0.015EU/mL四个浓度，作为细菌内毒素标准品溶液和细菌内毒素供试品溶液。取上述二个厂家的鲎试剂各72支，每支分别用0.1mL BET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素标准品溶液和细菌内毒素供试品溶液各0.1mL，每一浓度平行做4管，轻轻混匀。同时分别用0.1mL鲎试验用水和供试品溶液做阴性对照，平行做两管。垂直放入电热恒温水槽中，从放入开始准确记录时间，在（37±1）℃无振动保温（60±2）分钟。试验结果见表2。
通过上表的结果表明，2.5mg/mL供试品稀释液3个批号的供试品的Et值均在0.5～2Es范围之间，确认无干扰影响。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验[5]。
2 结果
检测三批注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素，检测结果均符合规定。
3 讨论
在本试验条件下，取三个批号的供试品，用BET水分别按上述方法配制成2.5mg/mL供试品稀释液，然后用λ=0.06EU/mL的上述二个厂家的鲎试剂各16支实验，供试品的Et值均在0.5Es～2Es范围之间，确认无干扰影响。注射用盐酸吉西他滨经过按细菌内毒素检查法实验后，确证了本品可以用稀释方法排除干扰，用细菌内毒素检查法（凝胶法）对供试品进行细菌内毒素的检测结果准确可靠。
[参考文献]
[1] 应荣，黄建，郭红云.盐酸吉西他滨原料合成工艺研究[J].精细化工中间体，2008，38（5）：34-36.
[2] 李留树，王如良.非小细胞肺癌的治疗进展[J].解放军保健医学杂志，2011，3：199-200.
[3] 陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学[M].北京：人民卫生出版社，2004：675-676.
[4] 许玉华，杜鹃，汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：46.
[5] 国家药典委员会编.中国药典二部附录[S].北京：中国医药科技出版社，2010：6，100-101.
（收稿日期：2013-10-09）