摘 要： 以萌发极晚的苹果品种酸王（Malus domestic cv. Avrolles）和对照品种瑞林（M. domestic cv. Judeline）为试材，测定被迫休眠期的呼吸速率、呼吸途径改变及呼吸途径关键酶活性的变化来研究酸王被迫休眠期的呼吸代谢特征，为选育避开晚霜冻害的晚萌发品种提供生理依据。结果表明，尽管酸王和瑞林芽内呼吸途径变化趋势一致，但运行活性和时间进程有明显差异。酸王的总呼吸和EMP途径呼吸强度低于瑞林，最高点分别是瑞林的84.6％和84.7％，PPP途径增加的时间比瑞林长21 d，且运行活性高于瑞林，变化幅度是瑞林的2.02倍；呼吸途径各关键酶活性、呼吸底物含量均低于瑞林，这些是酸王被迫休眠期的呼吸代谢方面的特征，在被迫休眠期的呼吸代谢提供的能量不充足限制了酸王的萌发。
关键词: 酸王苹果； 呼吸途径； 关键酶； 呼吸代谢
中图分类号：Ｓ６６1．1 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－953－０6
Characteristics of respiratory metabolism during Avrolles’ imposed dormancy
QIN Dong1，2， XIE Fu-chun1， ZHAI Heng2*， HUO Jun-wei1
（1College of Horticulture， Northeast Agricultural University，Ha’erbin， Heilongjiang 150030 China； 2College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University・State Key Laboratory of Crop Biology， Tai’an， Shandong 271018 China）
Abstract: In order to provide physiological bases for selecting late-germination cultivars that can avoid late frost damage， the very late-germination cultivar Malus domestic cv. Avrolles and the control cultivar M. domestic cv. Judeline were used as experimental materials to investigate the characteristics of the respiratory metabolism， the changes of respiratory pathway， respiratory rate and the key enzyme activity during imposed dormancy. The results showed that: changes of respiratory pathway in buds of Avrolles and Judeline had the same trend， but the running activity and time processing of the change were significantly different between the two varieties. The total and EMP respiration intensity of Avrolles were less than that of Judeline， the peak value was 84.6％ and 84.7％ respectively. Time for PPP accumulation in Avrolles was 21 days longer than that in Judeline， the running activity was higher and the amplitude was 2.02 times as that in Judeline. The activity of key enzymes and content of respiratory substrates in Avrolles were lower than that in Judeline. The energy provided by respiratory metabolism was not sufficient， which limited the germination of Avrolles.
Key words： Malus domestic cv. Avrolles； Respiratory pathway； Key enzyme； Respiratory metabolism
随着气候变暖，晚霜为害越来越频繁，给果树生产造成了巨大损失。选育晚萌发/开花品种是避免晚霜冻害的一个有效途径，山东农业大学抗性砧木研究室1998年利用农业部‘948’农业先进技术引进项目从法国引进了一批加工品种，从中发现了1个比大多数栽培品种晚萌芽3～4周的品种酸王（Malus domestic cv. Avrolles），在山东泰安4月下旬萌动，4月底或5月初开花，比其他品种如瑞林（M. domestic cv. Judeline）晚20～27 d[1]，能有效避开晚春霜冻。
呼吸代谢是生物氧化和物质转化的枢纽，其强度和途径转变影响并调控植物体器官的生长发育[2]。核果类果树芽呼吸速率在整个休眠期比较稳定，维持较低的代谢水平，休眠后期略有升高[3]。呼吸途径的改变与萌发的关系多以种子为试材[4]，并认为种子解除休眠和萌发有赖于磷酸戊糖途径（PPP）的活化；高东升[3]亦认为PPP途径的增强可能是核果类果树打破休眠的原因之一。
6- 磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH）和葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶（G-6-PDH）是PPP途径的2个重要的酶[5]，水稻种子萌发时6-PGDH和G-6-PDH活性及其辅酶NADP含量水平，都是随着种子器官的形成而提高，在萌发过程中表现为EMP逐渐被PPP所取代[6]，表明呼吸途径关键酶活性参与了种子的萌发，但有关呼吸途径关键酶活性的变化与芽萌发的关系研究甚少。呼吸代谢离不开呼吸底物（淀粉和可溶性糖）的消耗，淀粉向可溶性糖的快速转化是短时间高温破除桃休眠的部分原因[7]。
目前晚萌发品种在被迫休眠期的呼吸代谢未见研究报道。我们通过测定晚萌发品种酸王和对照品种瑞林芽总呼吸速率、3种呼吸途径呼吸速率的变化、呼吸底物、呼吸途径关键酶活性变化，探讨酸王芽在被迫休眠期的呼吸代谢特征，为揭示酸王晚萌发机理提供生理依据，同时丰富多年生果树休眠与萌发的理论知识，为培育晚萌发苹果品种提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
酸王和瑞林均是引自法国的加工苹果，酸王是原产法国布列塔尼地区的小苹果，在布列塔尼和诺曼底加工苹果产区作为高酸酿酒品种长期栽培[8]，其父母本不详，瑞林亲本为金冠×普利姆。在法国昂热国家苹果资源中心，酸王物候期比对照品种道曼晚30 d，引入山东烟台，辽宁兴城及甘肃天水，同样比其他品种晚20 d，表现出明显的晚萌动/开花特性。
试验所用试材取自山东泰安小津口加工苹果园酸王和瑞林的成龄树，树势中庸，管理水平一般。
1.2 方法
1.2.1 芽呼吸速率的测定 于2007年12月初至2008年4月从生长势较为一致的树体中部采1 a生枝约20条带入实验室立即进行呼吸速率的测定。利用生物氧检测器（YSI-53）和Oxytherm液相氧电极自动测定系统（英国Hansatech公司）进行测定，参照王海波[9]的方法，略有改动。枝条取来后用自来水冲洗2遍、去离子水冲洗1遍，吸水纸擦干，取枝条中部芽并剥除鳞片，将芽分切成大小一致的小块后准确称取0.3 g芽体，置于内有5 mL pH 6.8磷酸缓冲液的注射器中，反复抽气至芽子沉到液体底部，将抽提过的芽体置入氧电极反应杯中，准确加入1.5 mL磷酸缓冲液，加盖，启动转子以排除缓冲液中气泡并启动测量程序，待反应曲线稳定并达一定长度后，停止反应，记录数据。反应介质为20 mmol・L-1、pH 6.8磷酸缓冲液，测定温度25 ℃，重复3次。
呼吸抑制剂用注射器自氧电极上部加入，所用呼吸抑制剂加入顺序及其终浓度分别为（1）NaF 10 mmol・L-1，抑制糖酵解（EMP）途径；（2）丙二酸 50 mmol・L-1，抑制三羧酸循环（TCA）途径；（3）Na3PO4 10 mmol・L-1，抑制磷酸戊糖（PPP）途径；抑制剂用20 mmol・L-1、pH 6.8磷酸缓冲液配制。未加入任何呼吸抑制剂的呼吸为总呼吸，总呼吸减去加入呼吸抑制剂的剩余呼吸为抑制剂抑制呼吸途径的呼吸，即被抑呼吸（呼吸途径呼吸）=总呼吸-剩余呼吸。
1.2.2 呼吸途径关键酶活性测定 酶液提取：准确称取0.3 g芽，加入3.0 mL预冷pH=7.4的Tris-HCl缓冲液，冰浴研磨，4 ℃下，5 000 r・min-1 离心30 min，上清液为酶提取液，4 ℃下保存待测。
3种呼吸途径关键酶的活性测定参照李霞[10]的方法，磷酸己糖异构酶（PGI）活性测定磷酸己糖异构酶的催化产物6－磷酸果糖的产生量代表磷酸己糖异构酶的活性。苹果酸脱氢酶活性测定以苹果酸脱氢酶的催化产物NAD的产生量代表其活性。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH） 和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）联合活性测定以 6－PGDH 和G－6－PDH催化产物 NADPH的产生量代表6-PGDH 和G-6-PDH联合酶活性。
1.2.3 呼吸底物的测定 可溶性糖和淀粉采用蒽酮比色法[11]测定。
2 结果与分析
2.1 酸王自然休眠界定及萌发有效积温
在GXY智能型光照培养箱中用清水扦插法确定了瑞林解除自然休眠的日期在12月20―31日，酸王在1月20―30日。以5 ℃作为苹果自然休眠解除积累有效积温的起始温度，以日均温度超过起始温度的差值总和计算有效积温（∑T，℃）。在被迫休眠期，酸王萌发所需积温（∑T）为355 ℃，瑞林仅为105 ℃，酸王是瑞林的3.38倍（图1），2者有效积温符合一元二次方程[12]。
2.2 苹果芽总呼吸变化
2个品种自然休眠解除后，芽总呼吸均呈现“升－降－升”的变化趋势，但变化幅度和时间进程有显著差异（图2）。瑞林在解除休眠后呼吸速率持续增加，在32d内增加了66.8%，达到了6.62 μL・g-1・h-1，随后稍微下降后再次持续升高，在萌发前达到最高点，为7.88 μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的1.98倍。酸王的总呼吸变化相对于瑞林明显滞缓，在自然休眠解除后12 d内即达到第1个峰值，增加了1.9 μL・g-1・h-1，是瑞林的70％，在下降到峰谷后缓慢反弹，历经30 d恢复到第1个峰值的水平，萌发前 17 d内有一个快速上升过程并达到最高点，为6.60 μL・g-1・h-1，是自然解除休眠时的1.76倍，是瑞林的83.8％。相比较而言，酸王自然休眠解除至萌发期间，总呼吸强度弱于瑞林，萌发前上升积累的时间比瑞林长21 d。
2.3 芽内呼吸途径呼吸与关键酶活性变化
植物体内存在3条基本呼吸代谢途径，即三羧酸循环（TCA），糖酵解途径（EMP），磷酸戊糖途径（PPP）。其关键酶分别是苹果酸脱氢酶、磷酸己糖异构酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。酸王自然休眠解除后，其呼吸途径呼吸及呼吸途径关键酶活性发生了显著变化。
2.3.1 PPP途径呼吸及关键酶活性变化 PPP途径主要生理功能是产生供还原性生物合成需要的NADPH 以及可供核酸代谢的磷酸戊糖，一些中间产物则可参与氨基酸合成和脂肪酸合成。在萌发过程中，PPP途径关键酶G-6-PDH和6-PGDH联合酶的活性变化与PPP途径呼吸变化基本一致（图3）。
自然休眠解除后，芽内PPP途径呼吸不断增加，酸王在44 d内（3月15日）上升到最高点，为1.88 μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的11.8倍，于4月19日迅速下降到峰谷后再次上升，在萌发前达到1.65 μL・g-1・h-1，是最高点的88％。G-6-PDH和6-PGDH联合酶的活性与PPP途径呼吸变化相似，也是在44 d内达到第1个高峰值，为1.309 μmol ・g -1・ min-1，是解除休眠时的3.0倍，经过一个幅度为0.379的下降过程于4月10日开始上升，萌发前联合酶活性达到最高点，为1.533 μmol・g-1・min-1，是解除休眠时的3.52倍。
相对于酸王，瑞林PPP途径呼吸只需22 d上升到峰值，为1.26 μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的2.85倍，是酸王的67％，但关键酶活性则需要31 d才能上升到峰值，峰值为1.261 μmol・g-1・min-1，是解除休眠时的2.56倍。随后呼吸途径呼吸持续回落，萌发前的第2个高点仅为1.29 μL・g-1・h-1，是酸王的78.6％，而联合酶活性在2月23日下降到谷底后再次上升，萌发前联合酶活性上升到最高点，酶活性为1.453 μmol・g-1・min-1，略低于酸王（图3）。
2.3.2 EMP途径呼吸及关键酶活性变化 EMP途径是碳水化合物代谢的枢纽，其呼吸在2个品种芽内呈“双峰”变化，磷酸己糖异构酶活性的变化与呼吸速率变化趋势基本一致（图4）。酸王芽内EMP呼吸在自然休眠解除第12天上升到第1个高峰后迅速下降，峰值为1.39 μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的2倍；于3月3日下降到峰谷后再次持续上升，经26 d达到第2个高峰，萌发前3 d（4月24日）再次下降，峰谷为1.09 μL・g-1・h-1，比第1次峰谷高46.6％，萌发前略有升高。相对于酸王，瑞林在自然休眠解除后22 d增加了69％，达到了第1个高峰，比酸王高18.7％，于2月21日下降到峰谷，谷值是酸王的1.65倍，在第55天（2月23日）达到第2次高峰后缓慢下降，高峰值是自然休眠解除时的1.48倍。在整个阶段，瑞林EMP呼吸高于同时期的酸王。
酸王芽内PGI活性变化在休眠解除后23 d内变化不大，其后迅速升高，经过46 d（至4月10日）的上升达到最高点，酶活性为0.134 mg・g-1・min-1，是解除休眠时的2.16倍。在萌发前2周内有一个变化较为剧烈的过程。相对于酸王，瑞林芽内PGI酶活性出现较为明显的“双峰”变化，在休眠解除后22 d内，PGI活性由解除休眠时的0.068 mg・g-1・min-1迅速升高了74.2％，随后有所下降，至3月3日（休眠解除53 d）升高到最高点，最高点酶活性为0.153 mg・g-1・min-1，此后至萌发前，均保持在一个较高的水平（图4）。
2.3.3 TCA途径呼吸的变化 TCA是糖代谢的重要途径，也是各类有机物相互转变的枢纽和末端氧化的重要途径。两品种芽内TCA的变化趋势、变化幅度和苹果酸脱氢酶（MDH）活性变化基本一致，只是在时间进程上存在差异（图5）。
酸王和瑞林TCA呼吸分别经过12 d（2月11日）和22 d（1月21日）达到峰值，酸王略高于瑞林；随后均缓慢下降，酸王在第54天（3月25日）下降到峰谷，为2.43 μL・g-1・h-1，然后基本维持在一个恒定的水平，至萌发前3 d迅速升高到3.3 μL・g-1・h-1；瑞林在自然休眠解除后第43天（2月11日）下降到峰谷后再次升高，在萌发前上升到最高点为3.29 μL・g-1・h-1，与酸王几乎一样。在整个测定阶段，2者的变化幅度都在1.0 μL・g-1・h-1左右。而MDH无论是酸王还是瑞林在解除自然休眠后30 d内均有一个小幅度的升降过程，随着萌发的进行，MDH的活性不断增加，萌发前达到最高点，酸王为12.65 μmol・g -1・min-1，瑞林为12.86 μmol・g -1・min-1，酸王略低于瑞林。
2.4 芽内呼吸底物的变化
碳水化合物是果树生命活动的中心，同时又是呼吸的底物，尤其是糖类，是EMP呼吸的直接底物，因此碳水化合物浓度的改变影响着呼吸强度的变化。
自休眠解除后，无论是酸王还是瑞林，芽内可溶性糖含量均呈上升趋势，由于淀粉向可溶性糖的转化，致使淀粉含量变化与可溶性糖含量变化相反，呈下降趋势（图6）。酸王芽内可溶性糖含量由解除休眠时（1月31日）的56.5 mg・g-1上升到萌发前的76.1 mg・g-1，升高幅度为34.7％，而淀粉含量由59.74 mg・g-1下降到32.92 mg・g-1，下降幅度为44.8％。瑞林芽内可溶性糖和淀粉含量均高于解除休眠后同期的酸王芽内含量，瑞林在自然休眠解除时（12月31日）可溶性糖含量为72.6 mg・g-1，是酸王的1.28倍。淀粉含量为72.4 mg・g-1，是酸王的1.21倍；瑞林萌发前可溶性糖含量为89.5 mg・g-1，是解除休眠时的1.23倍，是同时期酸王的1.17倍，淀粉含量为44.84 mg・g-1，是解除休眠时的62％，是酸王的1.36倍。
3 讨 论
落叶果树芽休眠是一种相对现象，而非绝对的停止一切生命活动，在整个休眠与萌发期间发生着各种生理生化变化[13]，呼吸代谢为它提供能量。呼吸代谢旺盛，提供的ATP和中间代谢产物越多，越利于萌发。本试验结果表明，在自然休眠解除至萌发期间，酸王芽内的总呼吸强度弱于瑞林，在萌发前上升积累的时间比瑞林长21 d，这可能是酸王晚萌发的原因之一。
不同的呼吸代谢途径为生物体提供不同的能荷、还原力。EMP是碳水化合物代谢的开始阶段，是糖氧化降解的基本代谢途径，TCA将EMP途径代谢产物继续氧化，为植物提供丰富的合成原料和ATP能量；EMP-TCA是呼吸作用底物氧化的主要途径[14]。本试验研究表明，酸王和瑞林芽内底物氧化主要以EMP-TCA为主，但2者EMP途径代谢有明显差异，在所测定的阶段，酸王芽内的EMP途径呼吸速率低于瑞林，这可能与酸王芽内磷酸己糖异构酶活性相对较弱有关；TCA是呼吸代谢提供能量的主要途径，萌发前芽内TCA途径呼吸及关键酶MDH上升，表明萌发需要TCA所提供的ATP能量，而酸王芽内TCA呼吸强度及关键酶活性均低于瑞林，表明在休眠解除后的一段时间内，酸王芽内的能量供应和所提供代谢产物要弱于瑞林，也部分限制了芽的萌发。
PPP途径与种子休眠解除和萌发的关系已有诸多研究，多数认为PPP途径是种子萌发所必须的。PPP 途径的各种中间物是生物合成过程中必需的原料，特别是5-磷酸-核酮糖，是合成遗传物质 RNA 和 DNA 所不可缺少的物质[4]，而这是芽萌发时所必需的。本试验结果表明：PPP 途径的高活性对苹果芽的萌发起着非常重要的作用，酸王芽内PPP途径呼吸变化幅度是瑞林的2倍，增加积累的时间比瑞林长22 d，其关键酶G-6-PDH和6-PGDH联合酶的活性变化幅度为1.097，高于瑞林的0.961，这都表明酸王的萌发需要较长时间的高活性的PPP途径代谢。
可溶性糖是代谢的中间产物，它是由淀粉降解而产生，同时又作为呼吸底物被消耗，因此，可溶性糖含量的高低既与淀粉降解的速度有关，又与呼吸消耗的速度有关。可溶性糖含量的高低，反映了植株体内可利用形态的物质和能量的供应基础[15]。随着萌发的进行，芽内可溶性糖含量升高，淀粉由于向可溶性糖的转化而含量下降，酸王芽内可溶性糖含量远低于同时期瑞林，表明酸王芽内作为呼吸底物的可溶性糖不充足，致使芽内呼吸强度较弱，由此造成的能量不充足，部分限制了萌发。
酸王芽内总呼吸的相对较弱，EMP途径的较低运行，TCA途径的相对较低，较长时间的运行高活性的PPP途径，呼吸底物含量的相对不足，这些是酸王被迫休眠期的呼吸代谢特征，也可能是其晚萌发呼吸代谢方面的原因。有关各呼吸途径在酸王晚萌发过程中所占的比例及作用，以及对呼吸途径和关键酶活性的调控，补充呼吸代谢的能量能否改变酸王的晚萌发还需要进一步研究。
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