摘 要：基于SMART法，优化cDNA文库构建方法。将常规SMART法中的限制性内切酶SfiI替换成BsaI，在引物两侧分别加入BsaI-XhoI 和BsaI-BamHI酶切位点，仅使用BsaI单酶切即可获得两不同的粘性末端，可用于连接任意载体。应用此方法构建了小麦cDNA文库，获得2.7×104个独立克隆，文库平均长度500 bp。
关键词：cDNA文库；SMART法；BsaI
中图分类号： S512.1 文献标识码： A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.03.005
An Improved， Efficient Method for cDNA Library Construction of Triticum aestivum
XU Yan-fang， PAN Li-na， LIU Xiao-ying， WANG Zhen-ying
（College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ: A low-cost method based on SMART technique for cDNA library construction in Triticum aestivum was provied. In this study, the restriction endonuclease SfiI in the SMART technique was changed by BsaI, and the primer with BsaI-XhoI or BsaI-BamHI binding site was used for double-strand cDNA enrichment. The double-strand cDNA was digested by restriction endonuclease BsaI, which can form two different cohesive termini, and then it can be connected with any vectors. As a result, more than 2.7×104 independent clones were collected in the cDNA library, and the average sequence of inserts was 500 bp.
Key words: cDNA library;SMART method; BsaI
cDNA文库是真核生物mRNA集群的cDNA拷贝集合，它可反映细胞内整体的基因表达状况，是发现新基因和研究基因结构及功能的基础工具[1-3]。cDNA文库构建的关键在于获得全长cDNA[4]，目前，获得全长 cDNA文库的方法主要有Oligo-capping[5-6]、CAPture法[7]、SMARTTM法[4]、CAP-Trapper法[8-9]等。其中较为常用的是SMARTTM法(Switching Mechanism At 5’ end of RNA Transcript method)，该方法充分利用了反转录酶SMARTScribeTM的末端转移酶活性——当反转录达到mRNA 的5’端时，反转录酶SMARTScribeTM就能够在双链核酸的3’ 端添加几个脱氧胞嘧啶(dC)，而对于非全长cDNA，由于反转录延伸没有达到mRNA的5’端，反转录酶SMARTScribeTM不能在其不完整的3’末端加上dC[4]。同时，在cDNA的5’端和3’端分别引入SfiIA和SfiIB位点，由于SfiI酶是一种特殊的限制性内切酶，其对酶切位点中间的碱基要求不严格，而对两端的序列要求严格，因此，可改变酶切位点中部的碱基序列（即SfiIA和SfiIB均为SfiI酶切位点，但它们中部碱基序列为不同的限制性酶切位点），通过对目的cDNA进行单酶切(SfiI酶切)，即可得到两种不同的限制性内切酶的粘性末端，从而实现定向克隆。但该方法的SfiI酶为Clontech公司的cDNA文库构建试剂盒专用酶，相对成本较高。
本实验室将SfiI酶替换为一通用限制性内切酶BsaI，该酶仅对其识别位点后面的碱基进行切割形成粘性末端，据此可通过设计引物在cDNA的5’端和3’端引入BsaI酶切位点，并分别在BsaI识别位点后方引入不同的限制性内切酶（如XhoI和BamHI），在对目的cDNA进行BsaI单酶切即可得到XhoI与BamHI两种限制性内切酶的粘性末端，也可实现对目的基因的定向克隆。该方案一方面利用了反转录酶SMARTScribe可获得全长cDNA的特性，另一方面采用常规限制性内切酶BsaI替代了Clontech公司试剂盒中专用的SfiI酶，极大降低了文库的构建成本，又不改变定向克隆的策略，为cDNA文库构建提供了一种新的思路。
1 材料和方法
1.1 材 料
抗白粉病小麦Brock由 Ray Johnon 博士惠赠[10]。浸种发芽，待长至两叶期时均匀抖落白粉病菌。白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.tritici）为北京地区流行的15号生理小种，其毒力型为E09，分别在接种后4，8，12，24，48，72 h剪取叶片进行总RNA的提取，之后依浓度进行等比混合。
1.2 总RNA的提取
采用《现代分子生物学实验技术》一书中提供的方法创造一个无RNase的环境[4]，在其中进行RNA的提取和cDNA的合成。取一定量的样品于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末，采用TaKaRa公司的RNAiso Plus进行总RNA的提取，并用NanoDrop 1000检测RNA的含量和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳观察。 1.3 cDNA的合成
按照Clontech 公司SMARTScribe Reverse Transcriptase的说明书，取2 μg的总RNA，合成cDNA的第一链，取10 μL单链cDNA做模板，使用TaKaRa公司M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，以SMART IVTM Oligonucleotide（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGTCTCCTCGA
GGGG-3’） 和CDS III Primer（5’- ATTCTAGAGGATCCGAGACCGACATG(T)30GC -3’）为引物，进行cDNA第二链的合成，并补齐平末端。以合成的双链作为模板，进行PCR扩增（94 ℃ 1 min，18 cycles for 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min），应用1%琼脂糖凝胶电泳去除小片段，将长片段回收，并使用BsaI酶切。
1.4 载体制备及质粒构建
将pcDNA3.1(-)质粒经 XhoI 和 BamHI 酶切后进行凝胶回收，获得线性化载体。取2.5 μL载体与6.5 μL片段，采用TaKaRa公司的T4 DNA连接酶16 ℃循环水浴连接过夜，并转化E.coli DH5α感受态细菌。
1.5 PCR筛选检测
从平板上随机调取100个菌落，进行菌液PCR。使用的引物：T7- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG，BGH- TAG AAG GCA CAG TCG AGG。程序为：94 ℃ 1min；35 cycles for 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 3 min；72 ℃ 5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.6 重组子的提取及酶切鉴定
用碱裂解法提取质粒[5]，用XhoI和BamHI进行酶切鉴定。
1.7 测序及序列分析
随机挑选菌落进行测序分析，并通过BLAST进行序列比对。
2 结果与分析
2.1 cDNA文库优化方法概述
本试验采用的cDNA文库构建策略基于SMART法，但将限制性内切酶SfiI替换为 BsaI，该酶仅对其识别位点后面的碱基进行切割形成粘性末端，据此可通过设计引物在cDNA的5’端和3’端引入BsaI酶切位点，并分别在BsaI识别位点后方引入不同的限制性内切酶，在对目的cDNA进行BsaI单酶切即可得到两种不同的限制性内切酶的粘性末端，并可与任意载体连接，同时实现对目的基因的定向克隆。该文库构建策略可简述如图1，首先抽提小麦叶片总RNA，应用SMARTScribeTM逆转录酶进行单链cDNA合成，该酶的末端转移酶活性可在完整的cDNA 3’端引入3个胞嘧啶C，而不完整的cDNA 3’端不能引入胞嘧啶C。随后的第二链合成引物分别含有BsaI-XhoI 和BsaI-BamHI酶切位点，且其上游引物末端含3个鸟嘌呤G，与完整cDNA末端的3个胞嘧啶C配对，从而保证新合成的双链cDNA均是全长，并含有BsaI-XhoI 和BsaI-BamHI酶切位点，采用BsaI单酶切即可获得两不同的粘性末端，再与具有同样粘性末端的载体连接，可获得全长cDNA文库克隆。
2.2 cDNA文库构建过程
RNA的质量是获得有效cDNA文库的关键因素，本试验采用Trizol法提取小麦叶片总RNA，取2 μL测定浓度及纯度，NanoDrop 1000分光光度计测定结果显示，该RNA样品的OD260/280为2.04，符合文库构建要求。同时，琼脂糖凝胶电泳显示（图2A），总RNA完整性良好，可进行下一步试验。
富含大量长度不等的全长cDNA是高质量的cDNA文库的重要特征，而cDNA是由mRNA经过反转录得到的。植物中mRNA的大小一般集中分布在0.4~2.0 Kb，因此反转录后的全长cDNA的大小只有集中在该范围内时，才有可能是高质量的cDNA[11]。采用Clontech公司的反转录酶SMARTScribeTM进行反转录。第一链cDNA制备完成以后，利用含BsaI-XhoI 和BsaI-BamHI酶切位点的引物合成双链cDNA，电泳检测双链cDNA的合成质量。如图2B所示，双链cDNA长度均大于500 bp，且在1 000 bp以上有明显cDNA条带，说明该双链cDNA合成质量较高，可用于文库构建。
为获得长片段cDNA克隆，1%的琼脂糖凝胶电泳用于纯化双链cDNA，切除小片段，仅对大片段进行回收，如图2C所示，所得双链cDNA长度均在1 000 bp以上。将此双链cDNA进行BsaI单酶切，并连接载体，转化E.coli DH5α感受态细菌获得cDNA文库。
2.3 cDNA文库质量检测
随机挑选100克隆，应用T7和BGH引物（载体通用引物）进行菌落PCR发现，文库的长度范围在0.25~4 kb，平均长度约500 bp（图3），说明其符合文库构建的基本要求。为进一步排除假阳性，随机挑选23个克隆，进行质粒提取，并采用XhoI 和 BamHI双酶切，同时应用T7和BGH引物进行PCR验证，如图4所示，3条泳道分别代表：质粒，XhoI 和 BamHI双酶切质粒，T7和BGH引物PCR扩增。结果发现，多数质粒的酶切验证结果与PCR片段长度一致，部分片段酶切后片段偏低或出现多个片段，可能由于片段内部具有XhoI 或 BamHI酶切位点，综上，该文库质量符合cDNA文库构建要求。
2.4 序列分析
为进一步验证文库构建质量，随机挑选克隆进行测序发现，多数克隆均为小麦EST片段，也有已知小麦基因如小麦ATP合酶CF-O亚基I和III，小麦吡哆醛激酶（SOS4）mRNA等，说明该文库可用于筛选小麦抗病基因。
3 讨 论 RNA的纯度和完整性是cDNA文库质量的重要影响因素，因此，必须保证RNA的纯度高且无降解。本试验提取的RNA无蛋白质和基因组DNA的污染，琼脂糖凝胶电泳显示18 S和28 S rRNA这两条带清晰，说明其完整性较好，符合建库的要求。
本试验中采用了SMART技术的特殊反转录酶系统，保证了大片段的扩增，并且采用含有BsaI-XhoI 和BsaI-BamHI酶切位点的引物进行双链cDNA扩增，由于植物中BsaI的酶切位点相当稀少，经过BsaI酶切得到的基本上都是全长cDNA片段，而且这些片段拥有XhoI和BamHI的粘性末端，为后期与载体连接提供便利条件。同时，该方法采用的限制性内切酶可根据载体不同进行随机调整，可用于任意载体，极大增加了文库构建的通用性。这一方法克服了mRNA polyA尾合成cDNA技术路线的局限性，以及由反转录酶作用特点导致的局限性，同时扩增得到的cDNA不需要经过加接头、甲基化等操作就可以直接进行酶切、连接。
试验中采用了直接通过片段和载体连接后进行大肠杆菌的转化，省略了通常使用的噬菌体转染，不仅节省了时间，也缩减了试验经费。
试验结果证明，SMART方法经过改进后，不仅能得到质量较好的cDNA文库，使试验的时间和经费上都得到了压缩，也为今后小麦cDNA文库构建提供了一种新的思路。
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收稿日期：2012-04-01；修订日期：2012-05-22
基金项目：天津师范大学博士基金项目（52XB1005）；国家自然科学基金（31071671）
作者简介：许延芳（1986-），女，山西太原人，在读硕士生，主要从事植物抗性分子生物学研究。
通讯作者简介：王振英（1965-），女，天津人，教授，主要从事植物抗性分子生物学研究。