摘要： 采用大孔树脂纯化方法优选出纯化灵芝中总三萜的工艺。方法：D101大孔吸附树脂进行纯化，用醇-水梯度洗脱。灵芝样品浓缩液100 mL(0.5 s/mL)上大孔树脂柱(D15 mm×H120 mm，干重50g)，用蒸馏水1000 mL、60%乙醇 800mL、90%乙醇500mL依次洗脱，灵芝总三萜酸富集于90%乙醇洗脱液部分，且除杂质能力强.通过大孔树脂富集与纯化后的灵芝总三萜洗脱率达90.6%，90%乙醇洗脱液干燥后总固物中灵芝总三萜纯度可达20.3%。为此，采用此法可较好地纯化灵芝总三萜。
关键词： 灵芝； 总三萜； 纯化
中图分类号： TQ28 文献标识码： A 文章编号： 1009-8631（2012）04-0119-02
1 概述
灵芝是重要药用材料之一，在我国具有巨大的知名度，灵芝属于真菌界、伞菌亚门、担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、灵芝科、灵芝属[1]。灵芝多长于森林中，如腐朽的树桩等。明代药学家李时珍的《本草纲目》对灵芝的种类、颜色、气味、功效等做了比较详细的描述。在我国，主要分布于四川、贵州、山西、江苏、浙江、云南、山东、江西、广西、福建、台湾、湖南、安徽、海南、吉林以及河北等地[2]。2000版的《中华人民共和国药典》把灵芝列为药用菌[3]。灵芝的药理活性及功效己被广大人们所认可。20世纪50年代以来，随着人工培育灵芝的成功以及日后发展起来的发酵培养灵芝菌丝体的技术，灵芝的开发应用已经趋于大众化。市场上以灵芝为原产品也越来越多。
2 灵芝化学成分和生物活性
各种文献及实验研究证明灵芝具有多种药理作用，如:抗肿瘤、调节免疫功能、保肝、降血糖、降血压等等[4]。灵芝中所含的化学成分比较复杂，到目前为止，己经在灵芝中分离出了近200种化合物，分为多糖类化合物、三萜类化合物、核营类、吠喃衍生物、生物碱类、氨基酸多肤类、当醇类等十大类，而在灵芝中最主要的化学成分是多糖类化合物及三萜类化合物[5]，是最主要的功效成份，因此一直也是研究的重点。
3 灵芝三萜的提取、纯化和分离研究概况
3.1三萜类化合物的提取方法
灵芝中三萜类成分的分离及分析检测的方法很多，但各有其使用范围。选择最合适的提取分离及分析测定方法，除了要考虑分析的三萜类成分的结构性质外，还要考虑别的成分对它的干扰。因此，在实验室实际应用中应根据具体情况进行具体分析，确定最佳的提取分离及分析测定方法。灵芝三萜的提取方法有很多，例如有机溶剂提取法，超声波提取，临界流体萃取(SFE)等，其中最常用的是有机溶剂提取法。因为灵芝三萜是脂溶性的物质，而且其结构中含有羟基，使得此类物质具有一定程度的极性，根据相似相溶的原理及来源广泛和价廉等特点，本文选用乙醇作为提取溶剂，可用常规的回流提取进行。
3.2三萜类化合物的分离纯化方法
灵芝三萜化合物，文献报道大多是经过反复硅胶柱层析分离，较纯的部分再用薄层层析、低压柱层析、制备高效液相色谱等进行分离纯化[6]。
3.2.1吸附色谱法
硅胶柱色谱法是比较常用的三萜类化合物分离纯化方法，各种方法中洗脱液互有差异。黄伟光[7]等用氯仿-甲醇脱洗，配比为98:2，获得无定形苦味灵芝酸A；用95:5配比获得无定形微苦灵芝酸B。
3.2.2高效液相色谱法(HPLC)
HPLC检测三萜类化合物，具有快速、简便、灵敏的特点，已经得到广泛应用。邢增涛等用HPLC对同一灵芝株不同生长阶段及不同品种灵芝子进行研究，证实HPLC分离三萜类物质的良好表现[8]。
3.2.3大孔吸附树脂
大孔吸附树脂是新型的一项技术。大孔树脂通过表面吸附、表面电性或形成氢键等达到目的[9，10]。具有有机溶剂少，选择性好，吸附容量大，再生处理方便等优点。本文采用此纯化方法。
4 试药与仪器
4.1试药。灵芝药材（国琼紫灵芝）；D101大孔树脂（上海开平树脂有限公司）；齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所）；硅胶G；以下试剂均为分析纯：乙醇、甲醇、氯仿、石油醚、甲酸乙酯、甲酸。
4.2 实验仪器。旋转蒸发仪（N-1000，日本）；GB204电子天平（瑞典）；751型紫外—可见分光光度计（上海分析仪器厂）；树脂柱（杭州三特医药化工设备有限公司）等。
5 方法与结果
5.1灵芝三萜的提取。灵芝子实体，切片后烘燥、打粉。每次称取300克灵芝子实体粗粉置于2500ml的圆底烧瓶中，以95%乙醇作为提取溶剂，料液比为1:5、浸提温度为80度左右、浸提时间为1.5h，回流提取3次，待冷却后过滤，合并滤液，减压浓缩，可得浓缩液。
5.2 灵芝三萜的纯化。将新大孔树脂于95%乙醇溶液中浸洗24h后，用蒸馏水清洗至无醇味，再用5%盐酸浸泡24 h，用蒸馏水洗至pH值中性后， 接着用5%氢氧化钠浸泡24 h，再用蒸馏水洗至pH中性，用蒸馏水浸泡备用。
取预处理后的D-101大孔树脂各5g，置磨口锥形瓶中，加入三萜提取粗液10mL，于80℃下恒温水浴振荡0.5h，使其充分吸附。
5.2.1灵芝三萜类化合物。灵芝粉碎经7O％乙醇50℃恒温浸提24h，滤液经活性碳脱色，真空浓缩，用蒸馏水稀释至一定浓度，此样品用于静态吸附及解吸性能试验 。
5.2.2 标准曲线绘制附效果比较。精密称取齐墩果酸1Omg置容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释到50ml，浓度为0．2mg／ml。精密吸取齐墩果酸对照样品溶液0．1ml、0．2ml、0．3ml、0．4ml和0．5m1分别置于具塞试管中，加热挥去溶剂，加入新制的5%香草醛一冰醋酸 0．2ml和高氯酸0．8ml，在7O℃恒温水浴加热15min，流水冷却至室温，精密加入乙酸乙酯4ml，摇匀，于548nm处测定，以蒸馏水为参比溶液。三萜类化合物浓度与吸光度值之间的回归方程为：y=0．5628x-0．0578，R2=0．9986。 5.2.3 大孔树脂静态吸附率及解吸率测定。准确称取已预处理的大孔树脂2．50g，置于100ml具塞三角瓶中，加入20ml三萜类化合物溶液，置于室温振荡吸附24h后，测定三萜类化合物溶液的浓度。用蒸馏水洗去溶液中残余三萜类化合物后吸干水分。然后用95%的乙醇20ml溶液洗脱树脂，分别测定洗脱液中三萜类化合物的浓度，计算各树脂的吸附率和解析率。
5.2.4 大孔树脂吸附等温线测定。准确称取已筛选出适宜灵芝三萜类化合物分的大孔树脂5份，每份质量为2．5Og，置于100ml具塞三角瓶中，加入不同浓度的三萜类化合物水溶液20ml，于室温振荡 12h后，测定溶液中三萜类化合物含量，计算树脂的吸附量。根据吸附平衡后吸附量与水溶液中三萜类化合物浓度之间的关系，得到树脂吸附灵芝三萜类化合物的等温曲线。
5.2.5 大孔树脂的动态吸附试验。将一定量大孔树脂装柱，以浓度为0．99mg／ml的灵芝三萜类化合物提取原柱 ，流速2BV／h，分布收集流出液定时测定流出液中的三萜类化合物浓度，然后以洗脱液体积为横坐标，流出液中三萜类化合物含量为纵坐标绘制动态吸附曲线。
5.2.6 上样液最适pH值选择。将三萜类化合物浓缩液用NaOH或HCl溶液调至不同的pH值，上柱，依次用50ml同样pH值的蒸馏水及95%的乙醇水溶液依次洗脱，收集乙醇洗脱液，测定三萜类化合物的浓度，确定其最佳pH值。
5.2.7 洗脱剂及其浓度的选择。取一定量的三萜类化合物浓缩水洗脱至无色后，分别用50ml，50%～95%浓度的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度的乙醇洗脱液测定其三萜类化合物的浓度，以确定最佳的洗脱剂浓度。
6 结论
通过本次实验，灵芝总三萜纯化可用D101大孔树脂。灵芝样品浓缩液100 mL(0.5 s/mL)上大孔树脂柱(D15 mm×H120 mm，干重 50 g)，用蒸馏水1000 mL、60%乙醇 800mL、90%乙醇500mL依次洗脱，灵芝总三萜酸富集于90%乙醇洗脱液部分，且除杂质能力强.通过大孔树脂富集与纯化后的灵芝总三萜洗脱率达90.6%，90%乙醇洗脱液干燥后总固物中灵芝总三萜纯度可达20.3%。
参考文献：
[1] 李时珍.本草纲目(校点本)[M]．北京：人民卫生出版社，1982.
[2] 赵继鼎，张小青.中国真菌志[M].北京：科学出版社，2000：11-12
[3] 林志斌.灵芝的现代研究[M].北京：北京医科大学出版社，2007：125-195.
[4] 国家药典委员会，中华人民国和国药典2000版，北京：化学工业出版社.
[5] 林志斌.灵芝的现代研究[M].北京：北京医科大学出版社，2007：125-195.
[6] Lin，S.B.，Li，C.H.，Lee，S.S.，&Kan，L.S.（2003）Life sciences 72.2381-2390.
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[8] 邢增涛，郁琼花，张劲松等.不同品种灵芝中三萜类化合物的比较研究[J].中药材，2004，27（8）：575-576.
[9] 闫磊，何再安，刘炎文.大空吸附树脂在重要研究中的应用[J].时珍国医国药，2006，17（12）：2585-2586.
[10] 陈华絮，肖生鸿，杨素娇.苦瓜总皂苷的提取及含量测定[J].安徽农业科学，2007，35（18）：5556-5558.