摘 要：动物性食品安全问题已成为一个全球性议题。动物性食品中抗生素残留超标、安全性差的问题十分突出。建立一种准确、灵敏、可靠的分析动物性食品中抗生素残留的方法刻不容缓。本文介绍液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)应用于动物性食品中抗生素残留的检测方法。
关键词：液相色-质谱联用；动物性食品；抗生素残留；检测
中图分类号：F407.82文献标识码：B 文章编号：1009-9166（2008）33（c）-0043-02
目前，对检测食品中兽药残留的方法有很多：微生物学检测法、免疫分析法、色谱法，还有新近研发的生物传感器、纳米材料、生物芯片等技术。微生物检测法是测定抗生素残留的经典方法，具有前处理简单、经济、批量大等优点，但精确度、准确度和特异性不高,缺乏灵敏度。本文就近两年将液相色谱-质谱联用技术(LC/US)应用于动物源性食品中几种常见兽药残留的检测方法做一个综述。
一、对动物性食品中抗生素残留的测定
（一）、硝基呋喃类
硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因.硝基呋喃类药物对光敏感，代谢快，母体化合物在动物体及其产品中很快就降至检出限以下，但其代谢物以蛋白结合物的形式在体内可残留较长时间。显然，检测硝基呋喃类药物母体化合物已不能反映真实的用药情况。目前，各国均将硝基呋喃代谢物作为指示硝基呋喃类药物残留的标示物。研究动物组织中4种硝基呋喃类代谢产物AOZ、AMOZ、SEM和AHD的自动固相萃取HPLC-MS分析方法，以2-氯苯甲醛和2-硝基苯甲醛作为衍生化试剂。色谱柱：Intersil ODS，150mm×4.6mm，5μm(GLScience Japan)；以乙腈-0.1%甲酸为流动相，采用梯度洗脱。流速：0.6mL/min，进样量：30μL。离子化模式:正离子API-ES。采用两种不同衍生化试剂硝基呋喃代谢产物选择离子(SIM)，对于2-氯苯甲醛衍生物AOZ、AMOZ、SEM和AHD的同位素离子分别为:m/z225∶227：m/z324∶326：m/z198∶200：m/z238∶240。对于2-硝基本甲醛衍生化物AOZ、AMOZ、SEM、AHD的选择离子分别为:m/z 335、m/z 236、m/z 209、m/z 249。回收率为85%~90%：检出限可达0.5μg/kg。采用硫酸锌和亚铁氰化钾脱蛋白，电喷雾电离正离子方式(ESI+)、多反应监测(MRU)方式成功测定了奶粉中的硝基呋喃代谢物。流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸(含0.5mmol/L醋酸铵)，梯度洗脱：流速0.2mL/min，柱温30℃。4种代谢物内标法回收率在89.5%~110.3%之间。方法检出限(3倍S/N)AMOZ、AOZ为0.05μg/kg，SEM、AHD为0.1μg/kg，优于欧盟的要求[1]。采用高效液相色谱―电喷雾多级质谱(LC/MSn)同时快速、准确测定蜂蜜中呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃妥英4种硝基呋喃类抗生素代谢物。硝基呋喃类代谢物在酸性条件―F经过邻硝基苯甲醛衍生化，液相萃取后经色谱分离。色谱柱:ZORBAX 80A Extend C18150 mm×2.1mm，5μm(Agilent)。流动相：甲醇(B)和超纯水(A)，采用梯度洗脱。进样量：20μL：流速:0.2mL/min。质谱仪采用电喷雾正离子(ESI+)检测模式，扫描模式为二级质谱。加标样品平均回收率达到64%-79%，定量下限(LOQ)为0.1-1μg/kg，检测限(LOD)达到0.05-0.5μg/kg[2]。PPMulder等报道用液相色谱-串联质谱(LCMS/HS)确证定量检测禽肉及肝组织中的3，5-二硝基水杨酸肼(3，5-dinitrosalicylic acid hydrazide，DSH)代谢物。经酸性衍生化为NPDSH和NPHBH，乙酸乙酯提取，采用电喷雾负离子检测模式进行测定。NPDSH和NPHBH的[M-H]为m/z374，NPDSH的碎片离子为m/z182和226，而NPHBH的碎片离子为m/z 183。肌肉和肝组织中的检出限分别为0.04mg/kg，0.025 mg/kg，定量限分别为0.10mg/kg，0.05mg/kg[3]。
（二）、喳诺酮类
喹诺酮类(Quinolones，QNs)是1，4-二氢-4-吡啶酮-3羧酸衍生物的抗茵药，4-吡啶酮-3-羧酸是共同的功能基团，对细菌DNA螺旋酶具有选择性抑制作用。其中氟喹诺酮类(Fluoroquinolo-ne， FQs)是近十多年来研究最多、发展最快的一类合成抗菌药。由于不合理用药和滥用药的情况发生，因此，氟喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的重视。LC-MS法检测灵敏度高，能方便地对微量兽药残留组分进行检测，同时能对兽药残留组分进行结构确证，是目前检测食品中FQs残留确证检测的最佳方法之一。研究建立了水产品(鳗鱼、虾、鱼肉)中3种氟喹诺酮类抗菌素(PQs)残留量的LC-ESI-MS/US液相串联质谱测定方法。测定的3种氟喹诺酮类抗菌素：恩诺沙星ENRO、单诺沙星DANO、沙拉沙星SARA。色谱柱:LichroCART(r)，Pu-rospher(r)STAR RP-18e，125×2mm，5μm：流动相:乙腈(A)和0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱。流速:0.2mL/min：柱温：30℃：进样量:10μL。质谱条件：扫描方式：多反应监测(HRM)，正离子。3种氟喹诺酮抗菌素标准在1.0ng/mL-200ng/mL范围内具有良好的线性。样品检测限(LOD)0.5-2.9μg/kg，定量检测限(LOQ)分别为:1.8(ENRO)、8.2(DANO)、2.4(DIF)μg/kg，这种测定方法可作为原鳗、烤鳗、虾肉、鱼肉等样品的定量检测和确证方法，符合国外对氟喹诺酮类抗菌素残留的最大允许限量(HRL)要求[4]。
（三）、氯霉素类
氯霉素(Chloramphenico，lCAP)是一种广谱抗生素，能抑制细菌蛋白质的形成。动物源食品中氯霉素残留对人类的健康构成直接或潜在的威胁，特别是氯霉素导致人类再生障碍性贫血。用液相色谱-大气压光电离质谱(LC-APPI-MS)开发出测定鱼肉中氯霉素的方法。样品用乙酸乙酯萃取并挥发至干，然后用乙腈和正己烷萃取。分离柱采用ZorbaxEclipseXDB C18150×3 mm， 5μm，10mmol/L醋酸铵水溶液-甲醇为流动相：掺杂剂：丙酮，0.05mL/min：梯度洗脱：柱温：40℃：进样量：20μ：l流速：0.5mL/min。选择离子监测(SIM)：m/z321 [M-H]-。对于加入量为0.1-2ng/g的样品，小鲱肉和比目鱼肉中氯霉素的平均回收率分别为89.3%-102.5%和87.46-94.8%。LOD为0.07ng/ml。小鲱肉和比目鱼肉中氯霉素残留的检测极限(信噪比=3)分别为0.27ng/g和0.10ng/g。采用电喷雾电离源(ESI)，负离子模式采集，选取m/z：321/152为监测离子对测定对虾中氯霉素残留。用乙酸乙酯提取。C18Inertsil 5ODS-2色谱柱(5μm，2.1mm×50mm，Meta ChemTechnolegies Inc.)：甲醇为流动相，流速为300μL/min，进样量为20μL。该方法线性范围为0.28~28μg/L，相关系数r=0.99991。定量检测下限0.07μg/kg。牛英娟等建立了液相色谱/电喷雾离子阱(Q-Trap)质谱测定虾中氯霉素残留的分析方法。色谱柱：InertsilODS-3柱(2.1mm×15cm，5μm)。流动相：乙腈0.01mol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱。流速0.5mL/min，进样量5μL：柱40℃：检测波长278nm。MS条件：电离方式(-)API-ES，选择离子模式，对m/z321进行MS2检测。浓度为0.1~20μg/L的线性相关性系数为0.99953：浓度为20~1000μg/L的线性相关性系数为0.99803，回收率均在70%~116%范围内。岳振峰等以m/z321.0为母离子，m/z152.1、257.0和194.1为子离子，采用多反应监测(HRM)负离子模式对鸡肉组织中的氯霉素残留进行检测。采用微量化前处理方法。色谱柱：BDS C18，2.1×150mm，3.5μm：进样量：30μL：柱温：30℃：流速：300μL/min：流动相：乙腈-水(V/V10：90)，梯度洗脱。方法的检出限为0.010μg/kg(S/N≥3)，定量下限为0.10μg/kg，线性范围为0.100~1.00μg/L，加标回收率为74.3%~84.0%。氯霉素类抗生素除代表药氯霉素外，还有甲砜霉素和氟甲砜霉素。同时建立了鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素三种氯霉素类抗生素残留的高效液相色谱-电喷雾电离三重四极杆质谱测定法。色谱柱：XDB C18柱(150 mm×2.1 mm .id.，3.5μm)：进样量: 30μL：柱温:30℃：流动相:乙腈-水，流速：300μL/min，梯度洗脱。该方法采用多反应监测(MRU)负离子模式，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的定性分别采用m/z152.1和257.0，m/z185.1和290.1，m/z185.1和336.1，定量离子分别为m/z321.0/152.1，354.0/185.1和356.1/336.1。方法的检出限为0.010μg/kg，测定低限为0.100μg/kg，线性范围为0.050-1.00ug/L，加标回收率为69.0%-92.8%。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 （四）、β-内酰胺类
β-内酰胺类抗生素主要包括两类热不稳定的化合物：青霉素和头孢菌素。在兽医临床上，最为常用的β-内酰胺类抗生素包括青霉素G钾、青霉素G钠、氨苄青霉索、盐酸普鲁卡因青霉素、阿莫西林、头孢唑啉、头孢氨苄、硫霉素等。利用电喷雾四极杆串联-离子肼质谱测定牛奶中β-内酰胺类抗生素的残留量。该方法可检测5种p―内酰胺类抗生素(氨苄青霉素、阿莫西林、青霉素G、青霉素V和邻氯青霉素)和2种头孢菌素(头孢匹林和头孢噻呋)。样品用乙腈提取。用水/甲醇(含1%乙酸)梯度洗脱。氨苄青霉素、阿莫西林、头孢匹林和头孢噻呋用质子加合物[M+H]+进行定量，而青霉素G、青霉素V和邻氯青霉素则用钠离子加合物[M+Na]+进行定量分析。该方法可检测出美国FDA所规定的牛奶中允许检出量5ng/ml和安全使用量2.5ng/mL。最低检测限(信噪比=10)为0.2ng/mL(氨苄青霉素)，0.4ng/mL(头孢噻呋)，0.8ng/mL(头孢匹林)，1ng/mL(阿莫西林和青霉素G)，2ng/mL(青霉素V和邻氯青霉素)。利用弥散固相萃取柱(spersive-SPE)采用液质联用技术测定牛组织中β-内酰胺类抗生素的残留。弥散型萃取柱与传统的萃取小柱相比，操作简单，绝对回收率高。所检测的10种β-内酰胺类抗生素有：脱乙酰基头孢匹林、头孢匹林、阿莫西林、头孢噻呋DCCD、氨苄青霉素、头孢唑林、青霉素G钠、苯唑青霉素、氯唑西林、萘夫西林和双氯西林。除了头孢噻呋DCCD回收率为58%之外，其余平均回收率≥70%。
结语：LC-MS对简单样品可进行分析前净化并具有几乎通用的多残留分析能力，用于对初级监测呈阳性反应的样品进行在线确证，其优势明显。液质联用系统是残留分析理想的检测手段。对于需要高灵敏度、宽适用范围、复杂基质的多残留快速筛选工作而言，液质联用无疑是首选的最佳检测手段。
作者单位：东北农业大学
参考文献：
[1]彭涛,邱月明,李淑娟等.高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉中硝基呋喃类抗生素代谢物[J].检验检疫科学，2003.13(6):23―28.
[2]蒋原,丁涛,沈崇钰等.液相色谱-电喷雾质谱联用检测蜂蜜中四种硝基呋喃类代谢物[J].畜牧与兽医.2005.37(3):12―15
[3]杨成对,宋莉晖,毛丽哈等.对虾中氯霉素残留的分析方法研究[J].分析化学.2004，32(7):905―907
[4]牛英娟,饶国瑛,张之旭.液相色谱/电喷雾离子阱质谱测定虾中氯霉素残留[J].分析化学.2004.32(12):1698
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