伍勇，唐瑶，王任媛，高美杰，徐坤，刘松青*，刘红玲
(1.成都师范学院 化学与生命科学学院，成都 611130；
2.特色园艺生物资源开发与利用四川省高校重点实验室，成都 611130)
川味香肠由于其独特的风味、营养及良好的贮存性而深受人们的喜爱[1]。但由于传统加工工艺存在不足，暴露出一些如脂肪含量过高、亚硝酸盐残留量较高等营养健康问题。进入21世纪，人们对食品的追求越来越讲究功能性，通过添加膳食纤维素成分，降低食品中脂肪含量，增加食品营养成分，满足人们对功能性食品的需要。
周亚军等[2]的研究表明，膳食纤维可增加食品营养素，使硝酸盐增加，改良香肠的质地与弹性。膳食纤维可以改善肉制品的感官品质，如色泽、质地、口感[3]。现代食品为满足营养健康的需求，特别是在如今肥胖高发的社会形势下，应逐步推进低脂肪含量、低添加剂食品。例如，王凯凯等[4]制得的新型燕麦香肠，膳食纤维的加入可显著降低肉制品脂肪含量。尤丽新等[5]添加20%荞麦制作出的新型营养香肠，起到了主食和副食互补的作用。因此，为降低香肠中的热量物质脂肪含量，可一定程度上通过膳食纤维替代。但粗粮膳食纤维的增加也给肉制品带来了口感粗糙、风味欠佳[6]、亚硝酸盐含量增加等问题。亚硝酸盐作为评价食品感官质量的指标，本文在单因素实验中以感官为指标进行品质的判定。为解决发酵香肠中亚硝酸盐可能超标的问题、提高香肠的食用安全性[7]，品质改良剂的添加十分必要。因此，为满足当代人群对健康食品的需要，降低传统香肠脂肪含量及人体消化吸收摄入等问题迫切需要解决。
研究发现，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)可在一定程度上降解亚硝酸盐，保证肉品的安全性[8]，延长其保质期。杨晶等[9]以从泡菜中筛选出的植物乳杆菌5-7-3为研究对象，发现该菌产生的有机酸对亚硝酸盐有降解作用；
陈桂柳等[10]将两种植物乳杆菌(LactobacillusplantarumH1和LactobacillusplantarumL1)添加到广式香肠中，降低了香肠亚硝酸盐含量。曲冬梅等[11]研究表明，植物乳杆菌不仅可以提高产品营养价值，抑制有害细菌的生长繁殖，而且很大程度上可以提高产品品质，降低亚硝酸盐的残留量。植物乳杆菌理论上可降低亚硝酸盐残留量，但不同微生物在香肠中对亚硝酸盐的抑制作用也存在差异，因此根据实际的香肠类型选择合适的菌种也是关键[12]。
本实验以植物乳杆菌(菌株JYLP-002)添加量、燕麦膳食纤维添加量、发酵温度为单因素，探究不同条件下发酵香肠的亚硝酸盐残留量、质构参数以及感官品质的变化。
1.1 材料与仪器设备
1.1.1 材料
猪肉、精盐、味精、白糖、酱油、黄酒、香辛料、肠衣、绳结：均购于成都市红旗连锁超市；
亚硝酸钠(食品级)、植物乳酸杆菌JYLP-002(植物乳杆菌Biogreen 300)：丹尼斯克(中国)有限公司。
1.1.2 仪器设备
721紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；
600Y粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；
NH310质构仪 深圳三恩时科技有限公司；
GT SNIC-L3超声清洗机 广东固特超声股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 基本配方
原料肉(以100 g猪肉为例计算，80 g瘦肉、20 g肥膘)，2.5 g精盐，0.2 g味精，3 g白糖，0.08 g辣椒面，1 mL酱油，2 mL黄酒，0.01 g亚硝酸盐，0.3 g五香粉，0.15 g花椒粉，0.3 g胡椒粉，肠衣适量。
1.2.2 工艺流程
参考香肠的一般工艺流程：原料预处理→菌种活化→搅拌腌制→灌肠打结→漂洗→烘烤发酵→成熟→蒸煮冷却→质量检验[13]。
1.2.3 操作要点
将原料进行预处理，将干肠衣放入温水中浸泡后对植物乳杆菌JYLP-002进行活化。将肥瘦比为2∶8的猪肉放入容器中，加入配料、添加剂进行搅拌腌制，然后进行灌肠与烘烤处理，最后进行感官检验。
1.2.4 基本工艺的预实验
按照“1.2.1”中的配方及用量，参照“1.2.2”的工艺流程，制作预实验的产品。成品切面光泽，肉色黑红，肠衣基本干燥完整，有肉制品独有的香味，确定了实验的可行性。
1.2.5 单因素实验
按照发酵香肠生产工艺的要求,通过单因素实验，分别确定对发酵香肠的感官品质起关键作用的植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量、燕麦膳食纤维粉添加量、发酵温度3个关键参数的最优值。
1.2.5.1 植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量对发酵香肠的影响
固定原料肉和调味料的用量，以原料肉为比例基准，在添加3.5%燕麦膳食纤维粉、36 ℃的条件下，考察不同植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)对成品品质的影响(加入到适量含糖质量分数4%的糖水溶液中，活化后一并加入搅拌混匀)，检测指标为质构、亚硝酸盐含量及感官评分。
1.2.5.2 燕麦膳食纤维粉添加量对发酵香肠的影响
固定原料肉和调味料的用量，以原料肉为比例基准，在添加0.3%植物乳杆菌JYLP-002冻干粉、36 ℃的条件下，考察不同燕麦膳食纤维粉添加量(1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%)对成品品质的影响，检测指标同“1.2.5.1”。
1.2.5.3 发酵温度对发酵香肠的影响
发酵温度不仅能通过改变酶活性而对脂肪氧化和蛋白质水解造成影响，而且能对美拉德反应起到促进作用。固定原料肉和调味料的用量，以原料肉为比例基准，在添加0.3%植物乳杆菌JYLP-002冻干粉、3.5%燕麦膳食纤维粉的条件下，考察不同温度(34，35，36，37，38 ℃)对成品品质的影响，检测指标同“1.2.5.1”。
1.2.6 响应面优化实验
根据Box-Behnken实验设计的原理，采用Design-Expert 8.0.6软件，进行三因素三水平共20个实验点的响应面中心组合实验，优化燕麦膳食纤维发酵香肠的工艺参数。以感官评分为响应值，选取燕麦膳食纤维粉添加量、植物乳杆菌冻干粉添加量、发酵温度为实验因素进行优化选择，以-1，0，1分别代表变量的3个水平。中心组合的因素和水平见表1。
表1 响应面实验因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment
1.2.7 感官评分
选择12名品评员(6名男生，6名女生)组成感官评定小组，分别以色泽20%、质地30%、外观20%、风味30%的标准[14]对发酵香肠进行感官评分。香肠样品切制厚度为5 mm，使用随机数字编码，并随机分发给品评员。最终以12名品评员评分结果的平均值作为实验结果，具体评分标准见表2，将每组样品评分3次计算平均值。
表2 发酵香肠感官评分标准Table 2 The sensory scoring criteria of fermented sausage
1.2.8 亚硝酸盐测定
参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺耦合形成紫红色染料，于波长 538 nm处测吸光度，绘制标准曲线。
主要步骤：称量5 g试样匀浆，加入饱和硼砂溶液和70 ℃水混匀，沸水水浴15 min，定量转移后加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液，沉淀蛋白后过滤，制备标液和样液，加入对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺混匀，静置后测定。
亚硝酸盐含量计算公式为：
式中：X1为试样中亚硝酸盐含量，mg/kg；
m2为测试用样液中亚硝酸盐质量，μg；
1 000为转换系数；
m3为试样质量，g；
v1为测定用样液体积，mL；
v0为试样处理液总体积,mL。
1.2.9 质构测定
剥去香肠肠衣，用双面刀切成 2 mm厚的圆柱体，用质构仪测定香肠的硬度、咀嚼性、黏性指标。
具体方法：用质构仪P50测试探头运行 TPA 模式，测前速度为2 mm/s，测试速度为10 mm/s，两次压缩时间间隔为5 s，测试距离为8 mm(样品厚度的40%)。每组样品平行测定3次[15]。
1.2.10 数据分析
通过控制影响香肠感官品质的因素，对植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量、燕麦膳食纤维粉添加量、发酵温度进行单因素实验。在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken进行实验设计，采用Design-Expert 8.0.6软件处理数据，采用回归模型方差分析的方法进行分析，对提取工艺进一步优化。
2.1 植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量对发酵香肠品质的影响
植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量对发酵香肠品质的影响结果见图1。
图1 植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量对发酵香肠品质的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum JYLP-002 lyophilized powder addition amount on the quality of fermented sausage
由图1可知，植物乳杆菌添加量显著影响香肠的咀嚼性、硬度(P<0.05)，添加量为0.4%的实验组咀嚼性、硬度显著高于其他组；
添加植物乳杆菌的各实验组黏度差异不显著(P>0.05)；
植物乳杆菌添加量超过0.3%可极显著地降低香肠的亚硝酸盐含量，感官评分未因添加植物乳杆菌而表现出较显著的差异。因此，综合分析可知，植物乳杆菌添加量在响应面优化分析中最小值可取0.3%，最大值可取0.5%。
2.2 燕麦膳食纤维添加量对发酵香肠品质的影响
燕麦膳食纤维添加量对发酵香肠品质的影响结果见图2。
图2 燕麦膳食纤维添加量对发酵香肠品质的影响Fig.2 Effect of oat dietary fiber addition amount on the quality of fermented sausage
由图2可知，燕麦膳食纤维添加量对硬度和黏度的影响不显著，而显著影响咀嚼性；
随着燕麦膳食纤维添加量的增加，亚硝酸盐含量呈上升的趋势，添加高剂量纤维素影响乳杆菌对亚硝酸盐的降解作用，为保持较低的亚硝酸盐含量，其添加量应控制在4.5%以下；
在感官方面，剂量超过3.5%则感官评分显著降低。因此，综合分析可知，可选1.5%～3.5%燕麦膳食纤维添加量作为响应面优化的范围。
2.3 发酵温度对发酵香肠品质的影响
发酵温度对发酵香肠品质的影响结果见图3。
由图3可知，发酵温度显著影响香肠的亚硝酸盐含量和感官评分，而对其他几个参数没有显著影响。在一定范围内升高温度可提高咀嚼性，但温度过高则导致香肠的水分含量降低，产品的硬度增加，感官评分降低。在36 ℃条件下发酵，可极显著地降低亚硝酸盐含量(P<0.01)。因此，综合分析可知，可选35～38 ℃为响应面优化的范围。
图3 发酵温度对发酵香肠品质的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented sausage
2.4 响应面优化
2.4.1 响应面实验设计及结果
响应面实验设计及结果见表3，质构咀嚼度回归模型方差分析见表4，亚硝酸盐含量回归模型方差分析见表5。
表3 响应面实验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment
表4 质构咀嚼度回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model of texture chewiness
续 表
表5 亚硝酸盐含量回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model of nitrite content
通过响应面方差分析得到质构咀嚼度响应值的二元多次回归方程式：Y=535.62-6.77A-17.71B+8.29C+7.33AB-24.56AC+7.23BC-35.10A2-61.83B2-11.87C2。模型确定系数R2=0.953 3，模型调整确定系数RAdj2=0.911 2，表明响应面值95.33%的变化能用该模型来解释，模型变异系数为0.98%，表明该模型的拟合程度较好。通过直接比较回归方程一次项系数的绝对值大小，可以判定各项因素的主次。各因素的主次顺序为B(燕麦膳食纤维添加量)>C(发酵温度)>A(植物乳杆菌添加量)。由表4可知，该二次回归方程的模型为极显著性回归模型(P<0.01)，且失拟项不显著(P>0.05)，说明建立的模型与实际有较好的拟合。
而亚硝酸盐含量响应值的二元多次回归方程式为Y=0.62-0.12A-0.02B-0.039C+0.019AB+0.041AC-0.011BC-0.062A2-2.391E-003B2-0.12C2。通过直接比较回归方程一次项系数的绝对值大小，可以判定各项因素的主次。各因素的主次顺序为A(植物乳杆菌添加量)>C(发酵温度)>B(燕麦膳食纤维添加量)。
2.4.2 因素交互作用影响分析
可通过降维分析的方法对某两个因素交互作用对质构咀嚼度的影响进行分析。如果响应面具有比较平缓的曲面坡度，则表明因素的变化对质构咀嚼度的影响不大。如果响应面具有比较陡峭的曲面坡度，则表明因素的变化对质构咀嚼度的影响较大，随着因素的变化，响应值会作出相应的敏感反应。
根据回归方程建立响应面图。由图4～图6可知，AC之间响应曲面坡度平缓，AB、BC之间响应曲面坡度陡峭，根据本研究所建立的质构咀嚼度回归模型，AC之间存在极显著的交互作用(P<0.01)，AB、BC之间的交互作用不显著(P>0.05)。
图4 植物乳杆菌添加量和燕麦膳食纤维添加量对香肠质构的影响Fig.4 Effect of Lactobacillus plantarum addition amount and oat dietary fiber addition amount on the texture of sausage
图5 植物乳杆菌添加量和发酵温度对香肠质构的影响Fig.5 Effect of Lactobacillus plantarum addition amount and fermentation temperature on the texture of sausage
图6 燕麦膳食纤维添加量和发酵温度对香肠质构的影响Fig.6 Effect of oat dietary fiber addition amount and fermentation temperature on the texture of sausage
通过各因素的真实值以及编码转换公式，最后得到植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量、燕麦膳食纤维添加量、发酵温度的最佳水平值，即通过回归模拟预测和再次实验验证，燕麦膳食纤维发酵香肠的最佳条件为植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量0.5%、燕麦膳食纤维粉添加量2.33%、发酵温度35 ℃。
植物乳杆菌添加量和发酵温度显著影响香肠的咀嚼性和亚硝酸盐含量，经工艺优化后，发酵燕麦香肠的最佳工艺条件为植物乳杆菌JYLP-002冻干粉添加量0.5%、燕麦膳食纤维粉添加量2.33%、发酵温度35 ℃，新型香肠在一定程度上增加了膳食成分，降低了食品脂肪含量。
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