马卉芳
(1.开封文化艺术职业学院,河南 开封 475004；
2.西北工业大学,西安 710072)
醋的历史由来已久，其风味独特、口感醇厚，因此作为家喻户晓的一种调味品，深受人们喜爱。香醋是其典型代表之一，经过其独特的发酵工艺，所得成品醋具有“酸甜适中、存久留香”的特点[1]。但是，醋的发酵过程尤其复杂，而目前对于香醋指标检测最常用的方法是近红外光谱法，也存在着较大的误差，可能和香醋真实指标状况相距较远。如果能精确检测香醋中总酸含量的分布，进而及时指导生产者调整生产工艺[2]，无疑对改进香醋品质有着重要的科学价值。
高光谱图像检测技术是近几年研发出的一种新型产品检测方法，在使检测产品状态无损的情况下能完整地测出其图像信息和光谱信息，即可以集图像技术和光谱技术于一体。其中图像技术能够反映出所测物质的形态学特征，而光谱信息则可反映被测物的结构和组成成分等[3-5]。高光谱图像检测技术自研发使用以来能够很好地满足食品检测领域中对于产品多特征信息提取的需要，因此目前已被广泛地应用于食品行业的质量检测、损伤程度识别和食品安全检测等方面[6]。
本研究拟对香醋各个发酵阶段的总酸含量进行快速无损分析[7]，分析这两种光谱波长筛选方法对香醋总酸含量预测模型的影响，以期实现对香醋总酸含量的快速预测。
1.1 材料与试剂
糯米：河南恒顺米业有限公司，产地江苏镇江；
大曲、快曲、种子醅：江苏恒顺醋业股份有限公司；
酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；
醋酸菌：中国菌种保藏室；
氢氧化钠、酚酞等均为国产分析纯[8]。
1.2 实验仪器
恒温培养箱、电子恒温水浴锅 河南国健医疗设备有限公司；
pH计、磁力搅拌器 嘉兴艾博实业股份有限公司；
灭菌锅 苏州阿尔法生物实验器材有限公司；
图像光谱仪 芬兰奥卢光谱图像有限公司；
卤钨灯光源(35 W) 北京卓立汉光仪器有限公司；
酸度计、碱式滴定管 上海普锐斯仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 香醋酿造工艺流程
糯米→粉碎→糖化处理→前发酵(酒精发酵)→后发酵(醋酸发酵)→熏醅→淋醋。
前处理：将粉碎后的糯米加水，浸泡24 h，然后进行蒸煮处理。
糖化处理：向蒸煮晾凉后的原料中加大曲搅拌均匀。
前发酵：将糖化后的原料放入发酵瓶中，瓶口使用8层纱布封口，发酵3 d，第4天密封，进行厌氧发酵，持续6 d。
后发酵：酒精发酵结束后，原料混合麸皮等，进行醋酸发酵，发酵9 d。
熏醅：将发酵结束后的醋醅按3∶7进行高温熏醅。
淋醋：醋醅加入4倍水，浸泡12 h，淋醋得到成品香醋。
1.3.2 高光谱无损检测系统
高光谱无损检测系统主要由两部分组成：高光谱采集系统和高光谱数据处理系统，即硬件系统和软件系统。硬件系统主要包括：高光谱摄像仪、光纤卤素灯(2个)、控制箱(SC100，北京光学仪器厂)、电控位移台(北京光学仪器厂)、计算机等[9-10]。
1.4 高光谱检测方法
1.4.1 采集装置
高光谱信息采集装置见图1。光谱仪测定范围为400～950 nm，光谱图像分辨率为2.8 nm，在进行样品的光谱信息采集时，所得图像的分辨率为778×1 625像素。
图1 高光谱图像采集装置Fig.1 Hyperspectral image acquisition device
1.4.2 采集步骤
在开始采集前，为了保证采集图像的清晰度，需要进行预实验。由预实验得出试验台工作参数：输送速度 1.25 mm/s，照相机的曝光率为50 s。具体采集步骤如下：
(1)打开所有实验设备；
(2)光纤灯预热10 min；
(3)载物台放于中间位置，然后调节输送装置的运动方向，使其缓慢经过相机下方，操作采集平台来把控整个采集流程，及时对实验数据进行保存。用同样的方法采集黑板和样品的高光谱信息[11-12]。
图2 高光谱反射图像采集系统Fig.2 Hyperspectral reflection image acquisition system
结束采集后，需要对采集得到的光谱图像进行黑白标定。在与样品采集相同的条件下，计算公式如下[13]：
式中：Rλ为光谱反射率；
Iλ为校正前的光谱数据；
Bλ为暗电流数据；
Wλ为标定板数据。
1.5 香醋理化指标的测定
1.5.1 香醋总酸的测定
参照 GB 18187-2000中氢氧化钠滴定法进行总酸的测定，改动后具体实验步骤：选取不同发酵阶段的香醋样液，分别吸取5 mL到100 mL容量瓶中，加水至刻度线混匀。吸取20 mL稀释液于200 mL烧杯中，加60 mL蒸馏水，用0.05 mol/L的NaOH标准溶液滴定，以pH计测定pH 8.2为终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。同时做试剂空白实验。
试样中总酸的含量(以乙酸计)按公式计算：
式中：X为样品总酸含量(以乙酸计)，g/dL；
V1为试样测定所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；
V2为空白实验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；
C为氢氧化钠溶液浓度，mol/L；
0.060为与1.00 mL氢氧化钠标准溶液相当的乙酸质量，g；
V为样品体积，mL。
1.5.2 香醋pH值的测定
选取上述相同样品，进行 pH 值的测定。取 50 mL上述测定总酸定容的样品液，将酸度计直接插入滤液中测得 pH 值，并记录数据。
1.6 光谱数据预处理
1.6.1 数据的采集与预处理
由于采集到的高光谱数据还存在由仪器引起的机器噪声、基线漂移等情况，从而造成数据信号具有波段多、信息量大、冗杂性强等特点，或者选取的样品成分分布不均，从而导致测定结果存在一定差异。因此，若直接对原始光谱数据进行建模，可能会产生较大误差，导致建模效率低、模型性能差，为了避免此情况，在建模之前需要对数据进行预处理及优化，以便于提高模型的检测精度和稳定性[14]。
预处理工作主要分为两方面：一方面，运用多元散射校正法从全部光谱中选取信息量大、噪声小、代表性强的波段用于数据分析。另一方面，通过标准正态变量变换法将选取出的波段进行压缩，尽可能多地将样本的有用信息压缩在某一区域，然后截去其他波段。运用PCA法分析，选取合适的图像信息，根据主成分图像在各波段下对应的权重系数图，选出特征波长[15]。将分散的光谱集中，可以有效实现对基线的校正。分析所得高光谱数据，找出最能代表香醋总酸分布规律的样本指标的特征图像，以提高后期数据处理的速度，同时去除多余信息[16]。
在光谱系统中选取每份样品中心位置30×30的矩形区域作为研究目标，矩形区域的选择要保证总酸真实值的测定区域与光谱波段区域一致。通过计算得出各个区域内的光谱响应值，从而估算样品的相对反射率。选取的180份样品共获得 180条反射光谱，由于每个样品均有3次平行实验，故选择60条光谱进行分析。
(a)感兴趣区域 (b)原始光谱
1.6.2 模型的建立
1.6.2.1 联合区间偏最小二乘法(siPLS)
偏最小二乘法原理：选择区域内相对精度较高的几个局部模型所在的子区间进行联合，然后通过计算得出香醋总酸的分布规律。根据上述预处理方法将整个高光谱图像检测区域分别划分为1，2，3，…，10个子区间，最优模型中所采用的波数点数目减少很多，极大地简化了建模过程。然后将几个局部模型所在的子区间联合起来，得到共同预测模型[17]。
偏最小二乘算法的计算过程如下：
(1)矩阵分解：
Y=UQ+F；
X=TP+E。
式中：Q为Y的载荷矩阵；
P为X的载荷矩阵；
U为Y的得分矩阵；
T为X的得分矩阵；
F为X的残差矩阵；
E为Y的残差矩阵。
(2)线性回归模型的建立：
U=TB；
B=(TTT)-1TTY。
式中：B是关联系数矩阵。
(3)对未知样本的预测：
y=xBQ。
式中：y为未知样本预测值；
x为未知样本矩阵。
1.6.2.2 逐步线性回归模型
本实验采用多元线性回归法，以PCA分析得到的数据作为输入量，并将其运用到SMLR模型中，从而得到主成分与总酸实测值的分析模型。为了使模型更实用简化，同时能够较准确地得到香醋总酸的预测分布，得到线性方程：
y=b0+b1x1+b2x2+…+bkxk+e。
式中：k为变量个数；
b0为常数；
b1，b2，…，bk为偏回归系数；
e为误差项。
(∑e2)为最小的前提下，用最小二乘法求解偏回归系数。
为减小实验误差，将所选样品随机分成3份，其中2份(66%)为预测模型，1份(34%)用于验证。将2个预测模型进行比较分析。通过决定系数(R2)、预测均方根偏差(RMSEP)、以及相对分析误差(RPD)和最佳因子数来评价模型的稳定性。当R2接近于1，RPD>3时，建立的模型效果较好，建模结果分析见表1。
表1 建模结果分析Table 1 Analysis of modeling results
2.1 总酸及pH测定结果
2.1.1 总酸含量的变化
总酸反映的是发酵过程中有机酸物质总量，是香醋中酸味的主要来源，也是评价食醋的重要指标。在整个香醋的发酵过程中，总酸百分含量的整体变化趋势为前 9 d 持续增加，最高为 4.09%，9～15 d增速减缓，并持续增加至7.15%，在15～18 d基本稳定在7.5%～8.5%之间。每个样品分别设定3组平行实验，平行测定的最大相对误差不大于3%的总酸含量的统计结果见表2。
表2 样本总酸含量统计Table 2 Statistics of total acid content of samples
2.1.2 pH值的变化
pH值反映的是电离酸物质的 H+浓度，其在一定程度上表示产品酸味的强弱。其测定结果范围统计见表3。发酵过程中香醋pH变化的整体趋势为起先随着发酵时间的增加，pH逐渐降低，可能是在醋酸发酵过程中醋酸菌产生了作用，从第6天～第9天，pH值降至3.59左右，之后变化不大，保持平稳，15 d之后逐渐有缓慢增长的趋势。
表3 样本pH统计Table 3 Statistics of pH of samples
2.2 高光谱测定结果分析
2.2.1 偏最小二乘法预测模型的建立
运用siPLS法对香醋总酸分布预测结果进行模型建立，将预处理的光谱和实测值划分为校正集和预测集，然后进行模型建立，结果见表4。
表4 总酸、pH值的siPLS预测模型建立结果Table 4 Establishment results of siPLS prediction model for total acid and pH value
在联合区间数为4，主成分为8，联合区间[5 9 12 14]，光谱范围分别是577.98～620.45 nm，735～755 nm，810.1～824.5 nm，845.3～868.4 nm时，醋醅中总酸含量的 siPLS 模型的结果最佳，其Rc和均方根误差分别为0.845 2和0.521。Rp和均方根误差分别为0.812 3和0.695，该模型精度最高，预测能力最强。同时利用模型对香醋pH值进行预测，当联合区间为4、主成分数为6、区间数为[4 8 11 13]时，获得的模型最佳。此时训练集的相关系数为0.936 6，均方根误差为0.056 2。Rp和均方根误差分别为0.921 7和0.053 1。由结果分析可知，将精度较高的几个局部模型联合起来建立香醋发酵过程中总酸的预测模型是可行的。该模型在所有模型中精度最高，预测能力最强。
2.2.2 主成分分析
高光谱图像采集系统搜集到的波长有很多，形成了一个 M×N×λ 的三维数据。为了进行主成分分析，需将所有数据按某一维度展开，列为矢量。
由于测定总酸所使用的样品与高光谱采集样品相同，因此可以通过直接计算各个主成分图在该位置的平均灰度值，然后按照平均灰度值和对应的总酸含量进行相关性分析。利用得到的主成分系数矩阵与原校正集的光谱矩阵相乘，再取转置后即得到了醋醅光谱的主成分。每个样品选取10个主成分。其他成分相关系数较低，与总酸含量都呈极弱或无相关性，难以用来做模型预测分析。使用SPSS分析软件对数据进行处理，建立主成分与总酸实测值的模型。以主成分作为变量，多元回归所得结果见表5。
表5 基于主成分的模型预测结果Table 5 Model prediction results based on principal components
由表5可知，校正集R为0.814 3，均方根误差为0.594，预测集R为0.825 5，均方根误差为0.624。
通过高光谱图像检测技术，筛选相同样品条件下，香醋总酸和pH值分别对应的最优特征变量；
将其作为输入量，采用不同的建模方法，建立指标含量的定量模型，然后通过比较各模型得到预测结果。结果表明，高光谱图像检测技术在对香醋指标含量的快速测定过程中起着重要作用，可以建立精确度高的预测模型，且模型准确、简便，稳定性强。
本研究主要通过高光谱图像对香醋的总酸分布进行检测，从而预测分析香醋的总酸分布规律。通过采集不同发酵香醋的光谱波长，并分析发酵过程中总酸百分含量和pH值的变化情况；
结合选取的最优波段的光谱信息，建立最优的预测模型，通过对联合区间内精度较高的波长信号源进行选取，得到结果：总酸、pH 值的校正集相关系数分别为0.845 2和0.812 3，预测集的均方根误差分别为0.695和0.053 1；
结合主成分分析和逐步线性回归模型研究香醋中的总酸分布规律。结果表明，利用高光谱图像检测方法来预测香醋中的总酸分布规律具有可行性，能够为改进发酵产品生产工艺提供一定的理论研究基础，同时也为科学智能化地检测食品奠定了实质性基础。