勾蒙蒙，朱震宇,2*，赵 雨，闫秋林，王 颖
(1.陕西科技大学 化学与化工学院 天然产物稳定同位素组学实验室, 陕西 西安 710021；
2.陕西科技大学 陕西省轻化工助剂重点实验室，陕西 西安 710021)
植物、藻类和原核生物通过太阳能来合成有机物的整个过程被称作“光合作用”(photosynthesis).这一过程产生的有机物质，除了满足自养生物自身的需要外，对其它异养物种的生存也必不可少[1].植物中C、H、O同位素组成综合反应了植物光合作用过程中气孔导度和CO2的固定，可以作为植物在环境中生理机能变化的指标，用于研究植物生理与生态环境之间的关系.降水、温度、光照、土壤盐度、大气CO2浓度等因素都会在不同程度上影响植物叶片气孔导度和CO2的固定，从而引起植物合成有机质中δ13C、δ2H、δ18O发生改变[2-8].
在植物中，大气中的CO2通过气孔进入细胞，源水由根部运输到叶片，并受湿度、空气温度以及光照的影响蒸发富集.同时在光合作用下首先合成糖类化合物，一部分糖类化合物运输到茎部结合成纤维素，另一部分糖类化合物通过磷酸化、异构化为三碳糖并转变为丙酮酸，在丙酮酸脱氢酶复合体的催化下，丙酮酸被转化为乙酰-CoA，乙酰-CoA经缩合、还原、脱水、再还原等链延长步骤生成脂肪酸，最终脂肪酸脱羧形成正构烷烃[9-13].部分生物标志物的合成路径如图1所示.
生物标志物(Biomarkers)是由生物体产生，在生物死亡后经氧化、还原、裂解、加/去氢、异构化等一系列化学变化后，仍可保持源生化成分的特征结构[14,15].自20世纪50年代开始测定植物碳同位素丰度比以来，随着质谱测定技术的改进，稳定同位素分析在生态学领域取得了很大进展.Chad S.Lane[16]记录了正构烷烃的丰度、分布以及正构烷烃的δ13C和δ2H.Erika J.Freimuth等[17]等研究了温带森林中五种落叶被子植物的正构烷烃和正构烷酸产生的时间和数量的差异，以及叶蜡和水源水δ2H组成的季节变化.Xia Z Y等[18]表明了纤维素和降水δ18O之间的表观富集因子随着气温降低而增加.目前大部分的研究主要集中在植物样品中单一生物标志物稳定同位素与环境气候的响应关系，而对于植物特定器官特定位置中不同生物标志物的系统性同位素测定研究报道相对较少.网状脉的荷叶叶片具有尺寸大的优势，可以在同一叶片的不同片段中(<500 mg)提取叶片水、正构烷烃、α-纤维素以及脂肪酸，并通过单一叶片不同生物标志物的稳定同位素空间分布样式，进一步研究叶片水分同位素富集信号如何通过光合作用和后光合作用的复杂生物化学反应，进入合成的不同有机质当中(图1)，为叶片中不同生物标志物同位素信号用于气候、环境和代谢研究提供理论基础.
图1 部分生物标志物的合成图
1.1 仪器和试剂
1.1.1 化学试剂
二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯，均为色谱纯，Adamas-beta；
氯化钠、盐酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、亚氯酸钠均为分析纯，天津大茂化学试剂厂；
200-300目柱层析用硅胶，青岛海洋化工有限公司；
14%三氟化硼-甲醇，Sigma-Aldrich；
十八烷酸，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；
十六烷酸，河北百灵威超精细材料有限公司.
1.1.2 仪器设备
冷冻干燥机，Alpha 2-4 LD plus，CHRIST；
超声仪，昆山市超声仪器有限公司；
真空线路；
真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；
层析柱，欣维尔玻璃仪器有限公司；
旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；
循环冷却器，郑州长城科工贸有限公司；
磁力搅拌器，巩义市子华仪器有限责任公司；
全自动研磨仪，上海净信实业发展有限公司；
超纯水制造系统，西安优普仪器设备有限公司；
气相色谱，Agilent technologies 7890B；
Trace 1300/ISQ气质联用仪，ThermoFisher Scientific；
同位素比质谱仪，MAT 253 Plus IRMS.
1.2 样品采集
野外种植的荷叶叶片于2021年7月～2021年9月在陕西科技大学(陕西，西安)进行采摘.从茎部切下完整叶片，由中心向边缘分为6圈，每圈细分为4个小段，总计24个片段(如图2所示，每段编号细分并按字母顺序从中心到边缘标记).
图2 荷叶叶片切割图
1.3 实验方法
用于水提取的叶片段立即密封在预先标记和预冷却的塑料管中，并在野外用干冰冷冻，在水提取前放入实验室冰箱中冷冻保存.提水完毕后，再提取烷烃，脂肪酸和α-纤维素，实验流程如图3所示.
图3 实验流程图
1.3.1 叶片水提取
使用真空提取线路进行冷冻蒸馏提取叶片水.通常在提取的初始和最后阶段达到<1 Pa的真空，确保叶片水提取完全，以降低由于冷却蒸馏所导致的同位素分馏效应.提取的水通过0.22 μm PTFE过滤器，以去除可能干扰同位素分析的杂质颗粒.
1.3.2 样品制备
将提水完毕的荷叶片段(采集于陕西科技大学)使用全自动研磨仪将样品磨成粉状.
研磨基本参数：研磨预设频率，60 Hz；
研磨运行时间，30 s；
2次.
1.3.3 烷烃提取
(1)超声法[19]
称取300 mg的荷叶粉末于50 mL具塞离心管中，加入15 mL二氯甲烷-甲醇(2∶1，v/v)溶液，室温下超声三次，每次40 min过滤收集上清液，将收集到的上清液进行旋蒸，得到蜡质总提取物.提取物以正己烷做淋洗剂，经活化后的硅胶柱(200～300目)，将其分离为烷烃组分和其他组分，其他组分用乙酸乙酯淋洗后进行保存.
(2)索氏抽提法[20]
取250 mL二氯甲烷-甲醇(2∶1，v/v)溶液，倒入500 mL平底烧瓶中，搭建索氏抽提装置，取300 mg样品用滤纸包裹起来放置在抽提管中，75 ℃加热24 h.汽化的溶剂被冷凝循环水冷却，在索氏提取器中储存，实现对有机质的反复提取，接着用柱层析的方法分离烷烃组分.
1.3.4 混合脂肪酸提取及甲酯化
(1)皂化法[21]
取100 mg荷叶样品，加入10 mL 1 mol/L NaOH-CH3OH溶液，于70℃加热回流1 h，得到脂肪酸钠盐.待冷却至室温后，离心取上清液.转移至分液漏斗中，加入少量正己烷反复洗涤水相3次以除去小极性物质.使用1 mol/L的HCl溶液将水相pH调节至1-2，转移至分液漏斗中加入正己烷萃取3次，合并有机相.用饱和NaCl溶液反洗有机相，随后在有机相中加无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到混合脂肪酸.
(2)系统性提取皂化法
在章节1.3.3中，正己烷淋洗过后的硅胶柱，再用乙酸乙酯淋洗出剩余的有机质及色素，置于50 mL圆底烧瓶中，旋蒸，再加入10 mL 1mol/L NaOH-CH3OH溶液，于70 ℃加热回流1 h.待冷却至室温后.转移至分液漏斗中，加入少量正己烷反复洗涤水相3次以除去小极性物质.使用浓度为1 mol/L的HCl溶液将水相pH调节至1-2，转移至分液漏斗中加入正己烷再进行反复3次的萃取，合并有机相.用饱和NaCl溶液反洗有机相，随后在有机相中加无水硫酸钠进行干燥，将上清液盛放至旋蒸瓶中旋蒸除去溶剂，得到混合脂肪酸.
(3)脂肪酸甲酯化
向混合脂肪酸样品中加入1mL 14% BF3-CH3OH溶液，在75 ℃下回流搅拌30 min，反应结束冷却至室温，加入1 mL超纯水淬灭过量的BF3，再用正己烷萃取，反复2次.收集合并有机相得到混合脂肪酸甲酯.
1.3.5 α-纤维素提取
利用Zhou等[22]开发的方法提取纤维素.向1.3.3中超声后剩余的沉淀物里加入30 mL 17%NaOH溶液，室温下超声40 min，离心去除上清液，反复3次.用1%的盐酸将该体系的pH调节为中性，离心去除上清液.向该体系中加入NaClO2溶液(亚氯酸钠∶冰醋酸∶水=1.2∶1∶105)，放入烘箱中60 ℃条件下烘1 h，反复3次.最后将该体系中的pH调节为中性，进行冻干，得到高纯度α-纤维素.
2.1 不同生物标志物的GC-MS分析
采用Trace 1300/ISQ气质联用仪(ThermoFisher Scientific)对烷烃和脂肪酸甲酯进行定性分析.
(1)气相色谱条件
正构烷烃：采用HP-5(30 m×0.250 mm×0.25 μm)毛细管柱，进样口温度为300 ℃.该组分测定时程序升温条件为：80 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速度升至240 ℃，之后以10 ℃/min的速度升至310 ℃，保持时间为10 min.载气流速为1.2 mL/min.以He为载气，进样体积1 μL.
脂肪酸甲酯：采用HP-5(30 m×0.250 mm×0.25 μm)毛细管柱，进样口温度为300 ℃.该组分测定时程序升温条件为：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速度升至210 ℃，之后以4 ℃/min的速度升至245 ℃，最后以10 ℃/min的速度升至310 ℃，保持时间为5 min.载气流速为1.2 mL/min.以He为载气，进样体积1 μL.
(2)质谱条件
EI离子源；
离子源温度为280 ℃，传输线温度为280 ℃，电子能量为70 eV，发射电流为50 μA，电子倍增电压为1818.8 V；
质量范围50～650 amu.
2.1.1 烷烃总离子色谱图
烷烃GC-MS色谱如图4所示.从分析谱图可以获得荷叶叶片内所含烷烃种类及其相对含量，具体见表1所示.
图4 正构烷烃部分总离子流色谱图(total ion chromatogram，TIC)
表1 荷叶叶片中正构烷烃的GC/MS结果
2.1.2 脂肪酸甲酯总离子色谱图
脂肪酸甲酯GC-MS色谱如图5所示.分析谱图可以获得荷叶叶片内所含脂肪酸种类及其相对含量，具体见表2所示.
图5 混合脂肪酸甲酯部分总离子流色谱图(total ion chromatogram，TIC)
表2 荷叶叶片中脂肪酸的GC/MS结果
2.2 不同提取方法对烷烃提取率的影响
为了用更少量的植物样品提取出足够的烷烃，我们对比了索氏抽提法以及超声抽提法.各取300 mg叶片分别进行索氏法和超声法提取正构烷烃，通过GC-MS检测，并对每个色谱峰进行定性.考察不同提取方法对烷烃提取率的影响(图6).结果发现，对于系统性提取荷叶中的水、正构烷烃、脂肪酸以及纤维素，超声法提取率更高，对于后续测定GC-IRMS时更有优势.因此接下来的实验过程中将使用超声法进行正构烷烃的提取工作.
图6 正构烷烃提取方法对比
2.3 十六烷酸、十八烷酸定量分析
采用气相色谱(Agilent technologies 7890B)对混合脂肪酸中的十六烷酸、十八烷酸进行定量.
2.3.1 色谱条件
采用HP-5 MS(30 m×0.250 mm×0.25 μm)毛细管柱，进样口温度为300 ℃.该组分测定时升温程序为：初始温度70 ℃保持2 min；
10 ℃/min升温至300 ℃保持3 min.以N2为载气，进样体积1 μL.
2.3.2 标准曲线的绘制
分别配制十六烷酸、十八烷酸甲酯标准品1.1 mg/mL、1.2 mg/mL，分别移100 μL，150 μL，200 μL，250 μL标准储备液，用正己烷定容至1 mL，然后进行气相色谱分析.以标准液浓度(Concentration)为横坐标，对应的色谱峰面积(Area)为纵坐标绘制标准曲线，分别得到十六烷酸甲酯、十八烷酸甲酯的标准曲线分别为Area=4 960.6*Concentration-366.82，R2=0.995 1，p<0.05，n=4；
Area=3 560.9*Concentration-319.87，R2=0.991 4，p<0.05，n=4，如图7、图8所示.
图7 十六烷酸甲酯标准回归线
图8 十八烷酸甲酯标准回归线
2.4 皂化法与系统性提取皂化法之间的对比
衍生后对两者分别进行GC分析，将测得的峰面积代入回归方程，并计算出样品中十六烷酸、十八烷酸的含量.皂化法提取的十六烷酸、十八烷酸分别为0.414 mg/g、0.262 mg/g；
优化后的皂化法提取的十六烷酸、十八烷酸分别为0.225 mg/g、0.183 mg/g.由于优化后的方法与正构烷烃的提取具有连贯性，所使用的样品依然为提正构烷烃的300 mg样品，不需要重新取100 mg，所以优化后的皂化法更符合系统性提取水、烷烃、脂肪酸以及α-纤维素的要求.
2.5 α-纤维素红外分析
按照1.3.5的步骤，干燥后的纤维素通过Bruker-INVENIO傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)进行扫描测试，其扫描分辨率为4 cm-1，扫描范围为4 000～400 cm-1.荷叶的红外光谱分析结果如图9所示.
图9 荷叶纤维素的红外光谱分析
由图9可知，1 064.63 cm-1和896.83 cm-1处的峰，是纤维素中β-D葡萄糖苷键的特征吸收峰，3 409.89 cm-1处的强宽峰与纤维素分子中羟基的氢键O-H伸缩振动有关，2 904.58 cm-1处的峰与纤维素分子中C-H伸缩振动有关.1 622.01 cm-1处的峰应来源于纤维素的吸附水，1 402.14 cm-1处的峰归属于纤维素C-H和C-O的弯曲振动.
2.6 不同生物标志物的IRMS分析
2.6.1 GC-C-IRMS分析
使用Trace GC 1300GC、MAT 253 Plus IRMS，Isolink转换单元、Conflo IV通用接口和AS 1310自动进样器组成的GC-C-IRMS对实验样品进行分析.气相色谱升温程序与2.1保持一致.分离后的化合物通过Isolink转换单元在1 000 ℃的氧化还原管中转换为CO2，然后通过Conflo IV通用接口将CO2和其他副产物气体吹扫到IRMS中.在电离室中，CO2气体被电离为[12C16O16O]+、[13C16O2，12C16O17O]+和[12C16O18O，13C16O17O]+.通过检测m/z=44，45和46的信号，使用ISODAT 3.0数据处理软件，确定荷叶中正构烷烃和脂肪酸的δ13C值.
图10、图11分别为荷叶中正构烷烃和脂肪酸甲酯的C同位素的GC-IRMS图.可以看出，从少量荷叶样品中提取出的正构烷烃以及脂肪酸的量是足够用来分析的.
图10 荷叶正构烷烃GC-C-IRMS图
图11 荷叶脂肪酸GC-C-IRMS图
2.6.2 EA-IRMS分析
本研究中，植物氧(δ18O)同位素比率的质谱测定采用在线(online)分析测试系统完成，将叶片水和α-纤维素分别用液体以及固体自动进样器进行进样，用高温裂解元素分析仪(TC/EA)连接MAT-253-Plus气体稳定同位素质谱仪，在1360℃高温下分别将叶片水和纤维素样品裂解转化为CO，再通过ConFlo IV将CO引入稳定同位素比质谱仪(IRMS)测定18O/16O的比率.测量结果以相对维也纳标准平均海水(VSMOW)千分差(δ，‰或者mUr)表示，δ18O的误差范围控制在±0.5‰.
不同部位叶片水与纤维素的O同位素值趋势如图12所示.由图可以观察到，荷叶中叶片水与纤维素的O同位素值由叶心至叶边缘明显增加.
图12 不同部位叶片水与纤维素O同位素值趋势
为了将单一荷叶叶片进行更细致的划分从而对整个叶片的同位素空间分布有更精确的探究，本实验提出了用极少量的荷叶叶片可以系统性提出尽可能多的且足够的水、正构烷烃、脂肪酸以及α-纤维素的方法，并对其进行了表征以及同位素的测定.对比了提取正构烷烃的超声法和索氏抽提法之间的差异，并对提取脂肪酸的皂化法进行了优化，得到如下结论：
(1)在提取荷叶中烷烃时，相同用量超声法的效果最佳.
(2)系统性提取的皂化法更适用于本实验的流程，可以达到单个叶片利用的最大化.
(3)各个荷叶切片提出的正构烷烃和脂肪酸足够用来测GC-IRMS.
(4)在荷叶中，叶片水与纤维素的O同位素值由叶心至叶边缘明显增加.
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