张 钰，洪淑娥，刘家明，刘志礼，肖世宁，颜金祥，周 扬
1南昌大学第一附属医院骨科，江西 南昌 330006；
2南昌大学脊柱脊髓研究所，江西 南昌330006
尽管神经医学近年发展突飞猛进，但是脊髓损伤（SCI）仍是青年人致残的主要原因［1］。因此，如何改善脊髓损伤后运动功能的恢复仍是神经医学的研究热点［2-4］。目前，脊髓损伤基础研究最常用的为SD大鼠的SCI模型［5］，准确、客观的运动功能评价方法对于大鼠SCI后恢复程度的判断具有重要意义。
目前常用的评估大鼠SCI后运动功能恢复的方法有神经电生理［6,7］和BBB评分量表［8,9］。神经电生理评价具有客观性和准确性，易于定量分析。运动诱发电位（MEP）潜伏期具有良好的稳定性，能够准确、客观地判断大鼠SCI 后的严重程度，可作为一种金标准去评估神经损伤的程度［10-12］。但是由于神经电生理检测仪器昂贵以及熟练掌握其测量方法需要一定的学习曲线，其普及性欠佳。BBB评分由于其简易操作，其评估标准包括许多评定细节和特征说明，分级较细致，在大鼠SCI研究中被广泛应用［13-15］。然而，作者在对SCI大鼠的BBB评分过程中，发现BBB评分存在主观性较强，且在SCI大鼠恢复的早期（BBB评分量表中小于等于7分），其髋、膝及踝关节的活动不易观察等问题［16-18］。
因此，本研究利用SD大鼠在水中恐惧而激发其运动潜能，同时水中浮力减轻其臀部部分重力对后肢的压迫，使其后肢关节更易驱动且易于被观察的特点。将SCI大鼠放置于自制单通道透明水缸来评估大鼠脊髓损伤后的运动功能恢复情况，旨在提出一种新的脊髓损伤后运动功能评估方法，以便更加客观、准确地评估脊髓损伤大鼠的运动功能恢复情况。
1.1 实验动物
36只8周SPF级雌性SD大鼠（天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXΚ（湘）2019-0014），体质量200～220 g。大鼠饲养于具有独立换气系统的清洁笼内，动物房温度控制为22～25 ℃，湿度55%，保持光照规律变化。本实验过程中，所有动物的处理均符合动物伦理学标准（动物伦理号：CDYFY-IACUC-202207QR001）。
1.2 分组及造模
1.2.1 实验分组 实验前对所选大鼠进行常规行为能力测试，确保其运动功能正常。36 只大鼠经适应性饲养1 周后，采用数字表法将大鼠随机分为脊髓损伤组和假手术组，18只/组。
1.2.2 模型的建立 脊髓损伤组大鼠术前常规禁食，自由饮水。全部18 只大鼠在椎板切除后，Allen打击法［19］制备大鼠脊髓损伤模型：异氟烷全身麻醉满意后，大鼠取俯卧位固定于手术台上。无菌操作下于背侧入路暴露脊髓T10节段，用直径3 mm的10 g铁棒下落打击装置造成脊髓轻中度损伤（打击力量为15 g·cm）。假手术组大鼠仅暴露脊髓，不给予外力打击，并常规缝合。术后护理：SCI 大鼠模型建立后，控制环境温度在22～25 ℃；
每2只大鼠1笼喂养，保持饲养笼垫料干燥、清洁；
3次/d协助排尿，直到反射性膀胱排空形成，以及用干燥毛巾擦干被尿液浸湿的肢体及会阴部；
术后常规每日10万单位青霉素肌注预防感染；
术后皮下注射葡萄糖液5 mL，连续3 d，预防失血性休克及补充能量。
1.3 功能评价
1.3.1 两种脊髓损伤评分方法
1.3.1.1 水缸评分法 将待观察大鼠放入盛有5 cm深度温水的自制单通道透明水缸中，观察者从自制单通道透明水缸侧面观察大鼠后肢的活动，每只大鼠在单通道水缸内通过全程路线3 次，并观察其关节活动、承重步态、运动协调性进行综合评分。具体评分细则同BBB评分［20］：大鼠后肢功能评分为0～21分，正常大鼠为21分。自制单通道透明水缸（国家专利号：202121952501.1）：包括底部控温装置，可保证水温维持在38 ℃，水缸长150 cm，内槽宽度为10 cm，可以很好保证大鼠在其中没有拥挤感，但不能自由转身。使用时，其水深以刚好达到被观察大鼠的下颌，约5 cm。水缸周边玻璃有一定的放大设计，保证观察者从侧面可清楚的观察到大鼠后肢的活动，水缸尾部为黑色物包裹封闭设计，因大鼠喜黑，可诱导大鼠向前爬行（图1、2）。
图1 自制水缸的构造及其应用方法Fig.1 Construction of the self-designed water tank and its application.A: Schematic diagram of the self-designed water tank.B:Lateral view of a rat crawling in the water tank.The water level in the tank is below the jaw of the rat so that the activity of the hind limbs can be clearly observed.C: Top view of the rat in the tank,which is confined to crawl forward in the water tank.
1.3.1.2 BBB评分法［20］大鼠于旷场自由爬行，观察其运动4 min，每只观测3次。两种脊髓损伤评分方法的评分者为2名经过培训了解评分标准的非该实验人员，评分采用双人独立观察，最后结果为两位观察者的平均记录分数（图2）。两组大鼠在术后1、3、5、7、14、21 d，6个时间点均采用两种不同的脊髓损伤评分方法进行评分。
图2 水缸评分法与BBB评分法评分时SCI大鼠后肢活动观察的对比Fig.2 Assessment of hindlimb activity of SCI rats using water tank scoring and BBB scoring.A:The water tank scoring method,in which the activity of the hind limb of the rats can be clearly observed in the tank.B: BBB scoring method,in which the movement of the hind limb of SCI rats on the ground is relatively difficult for observation.
1.3.2 运动诱发电位（MEP）应用NIM-ECLIPSE生物信号处理系统（Medtronic,Inc.USA），刺激电极：分别置于大鼠头颅中线皮下和硬腭黏膜下。记录电极：分别置于后肢腓肠肌与跟腱处。大鼠大脑皮层接受刺激后，同时可以在下肢肌肉记录到MEP。两组大鼠在术前，术后1、3、5、7、14、21 d 检测大鼠MEP评估脊髓损伤恢复程度。
大鼠昼夜活动差别较大，所有评分及检测均固定于每个时间点晚上19点进行。评价前所有大鼠人工排除膀胱尿液，以免因膀胱充盈而影响大鼠活动。
1.4 统计学分析
采用统计分析软件SPSS 25.0 进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。正态分布资料采用Pearson相关分析，非正态分布资料采用Spearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 大鼠SCI造模术后一般情况
大鼠SCI造模术后1 h基本清醒，假手术组大鼠后肢关节可自由活动，自主饮水、饮食。脊髓损伤组大鼠表现为截瘫，两个前肢可爬行运动，但后肢和尾部无活动，出现尿潴留、腹胀等典型SCI表现。假手术组大鼠术后1 d其后肢肌力基本恢复正常，后肢协调性较好。脊髓损伤组大鼠主要靠前肢爬行移动，腹部贴地，双足底向上。所有大鼠切口均愈合良好，定期进行水缸评分方法评分的同时，予以水浴清洁护理会阴部。所有SCI组大鼠均无伤口及泌尿系感染迹象。但由于缺乏后肢活动，SCI组大鼠后肢较假手术组出现一定程度的肌肉萎缩。在整个实验过程中，因各种原因（如麻醉意外、咬伤、尿路感染、伤口感染、挤尿导致膀胱破裂等）而死亡的大鼠共1 只（其中假手术组0只，脊髓损伤组1 只：同笼大鼠打斗，咬开背部伤口致死），总死亡率为2.78%。实验过程中意外死亡大鼠及时补充，以确保每组大鼠数量与计划一致。
2.2 两种不同脊髓损伤评分法评分结果对比
脊髓损伤前所有大鼠使用水缸评分法和BBB评分法评分均为21分。
水缸评分法：SCI组大鼠伤后1 d均为0分；
损伤后3 d 开始有下肢恢复迹象为0.22±0.43分，伤后前2周恢复较快，大鼠SCI后5、7、14 d评分分别为0.67±0.49分、4.33±1.19 分、8.61±1.20 分，运动评分显著增高（P＜0.05）；
第21天达到14.78±1.06分，已可自主爬行，但是精细动作欠佳（表1、图3）。
表1 两种评分方法评分结果对比Tab.1 Comparison of the results of the two scoring methods(Mean±SD)
BBB 评分法：SCI 组大鼠在术后1、3 d 使用传统BBB 评分均为0 分；
损伤后5 d 地面旷场评分仅为0.11±0.32分；
损伤后7、14 d评分显著增高（P＜0.05），第21天达到14.5±1.47分，可观察到大鼠后肢自主运动爬行，但是精细动作欠佳（表1、图3）。
与BBB评分法相比，水缸评分法在造模后第3天开始评分更高，并在造模后第5、7、14天评分显著高于BBB评分法评分结果（P＜0.01，图3）。造模后14 d大鼠后肢功能逐步恢复，两种评分方法分值差距缩小，差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.3 大鼠MEP潜伏期监测结果
大鼠SCI后MEP潜伏期延长，波幅明显减小，SCI术后1 d潜伏期长达8.06±0.22 ms，随着时间的延长，潜伏期逐渐缩短，波幅逐渐增加，SCI术后14 d潜伏期缩短为6.29±0.34 ms，术后1、3、5、7、14 d脊髓损伤潜伏期均低于假手术组潜伏期（P＜0.01）。21 d后接近正常水平为5.87±0.28 ms（表2、图4）。
表2 两组大鼠各时间点MEP潜伏期测量结果Tab.2 Results of MEP latency measurements at different time points after SCI in the two groups(ms,Mean±SD)
图4 神经电生理监测结果图Fig.4 Electrophysiological monitoring results.A:MEP latency in normal rats(about 5.7 ms).B:The latency is significantly prolonged and the wave amplitude is significantly reduced at the initial stage of SCI,indicating that the motor pathway of the lower limbs is damaged.C:The MEP latency decreases over time while the wave amplitude gradually increases,indicating gradual recovery of the motor pathway of the lower limbs.
2.4 两种不同脊髓损伤评分法与MEP潜伏期的相关性分析
两种脊髓损伤评分方法得分与MEP 潜伏期均呈负相关（P＜0.01）。但水缸评分法与电生理MEP潜伏期的相关系数（r=-0.90）高于BBB评分法得分与电生理MEP潜伏期的相关系数（r=-0.86）。
建立一个客观、准确的大鼠SCI 动物模型后肢功能评价方法，对于大鼠SCI损伤程度、恢复过程及干预措施的效果的评价非常关键［21-23］。电生理是目前较为准确、客观的检测手段［24］，但其普及率不高。BBB评分法［20］是可简易评估大鼠后肢运动情况的一种方法，也是目前评价大鼠SCI后功能恢复的最常用评分标准［25-27］。BBB评分分值越高，表明后肢运动功能恢复越好。其中0～7分属于恢复的早期阶段；
8～13分进入恢复中期；
14～21分阶段代表大鼠精细运动恢复时期。而实际上，SCI大鼠早、中期评分时，SCI大鼠因后肢瘫痪，活动减少，并且其臀部因重力作用压住无力后肢，使得其后肢即使有微弱的肌力恢复也无法活动其髋、膝、踝关节，从而导致观察者无法准确、客观的的判断其下肢功能恢复情况。
本研究设计水缸评分方法进行评分：由于水的浮力抵消了SCI大鼠部分自身重力，即使微弱肌力恢复也可驱动下肢髋、膝、踝关节的活动，并且通过盛水玻璃的局部放大作用，大鼠下肢活动可被早期发现。此外，正常大鼠放入盛水水缸内，表现为有意高抬后肢动作，表现出一定的恐水性。因此，大鼠SCI后早、中期后肢活动能力得到激发，且水中浮力的存在使得SCI大鼠后肢活动更容易被观察者捕获，从而提高了该评分方法的准确性和敏感性。
本实验结果显示，水缸评分法和BBB评分法评分均能反映SCI 后大鼠后肢功能恢复过程，体现SCI后神经恢复的程度。但水缸评分法得分在SCI术后第5、7、14天均显著高于传统BBB评分。术后第5～14天，损伤大鼠下肢逐渐恢复运动，在自制水缸内观察评分，早、中期大鼠后肢尚不明显的屈伸活动更容易被观察者捕获。这可能是由于轻、中度脊髓损伤的在伤后第5天，开始有一定的下肢运动恢复。但是由于恢复早期，臀部的压迫影响了下肢的活动，导致两种评分方法有显著差异。伤后14～21 d两种评分方法无明显差异。这可能是由于SCI术后14 d脊髓损伤大鼠下肢肌力逐渐恢复，以至于可逐步承重爬行，并且传统BBB评分方法已经可以很好的观察大鼠后肢活动情况。因此，伤后14 d以上，两种评分方法没有明显差异。本研究使用的大鼠脊髓损伤模型为轻度损伤模型，因此在术后21 d BBB评分可达到14.50±1.47分，而马善峰等［28］在大鼠脊髓损伤术后6周评分仅为11.50±0.93分，这可能是由于不同研究需要和不同造模仪器参数导致的大鼠SCI程度不一致，但是本研究中使用同一批大鼠进行不同评分方法进行评分，评分方法结果差异的比较不受大鼠SCI程度影响。
进一步，本研究分析了两种脊髓损伤下肢功能评分法与神经电生理检测结果的相关性。神经电生理检测可较为客观的反映脊髓功能，在神经中枢、神经传导通路和效应器（肌肉）上，可以记录到特定位相的电变化，能够反映神经系统一定部位的功能状态［28］。本研究结果显示：水缸评分方法得分与MEP 潜伏期数值的相关性更高，高于传统BBB评分得分与MEP 潜伏期数值的相关系数（r=-0.90，r=-0.86）。有研究在进行大鼠脊髓损伤功能评价的研究中指出MEP与BBB评分有较好的相关性［10］，这与本研究结论一致。伊超凡等［16］研究表明脊髓在受到损伤时，其MEP潜伏期显著延长、波幅显著下降，且脊髓在受到重度损伤时，会出现波形明显变异，无法确认，因此本研究选择轻度损伤，从而更好的检测MEP的潜伏期。因此，本研究结果可以表明：水缸评分方法的评分结果与电生理定量数值具有更好的相关性，得出的评分更加客观、准确。
综上所述，水缸评分方法与BBB评分法相比，能够在大鼠SCI早期更客观、准确的反映脊髓损伤后的功能恢复过程。本研究结果为大鼠急性脊髓损伤模型后肢功能恢复的一种可靠的评估方法。
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