朱 娜，冯 婷，冯杨萌，封 青，李静艳
（陕西省人民医院a.科研处；
b.肾内科；
c.中心实验室，西安 710068）
肾间质纤维化是各种肾脏疾病进展到终末期共有的病理损伤过程，其发病机制复杂，主要由肾脏固有细胞转化成肌纤维母细胞 (EMT）并在肾间质中聚集、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）合成增多及降解减少、促纤维化细胞因子表达上调、单核巨噬细胞等炎症细胞浸润、氧自由基生成过多及肾间质细胞凋亡等多因素导致[1]。近年研究发现，慢性炎症刺激可诱导成纤维细胞的激活、EMT发生、细胞外基质蛋白，包括胶原蛋白I（Collagen-I）和纤连蛋白（fibronectin）的过度沉积，进一步导致肾间质纤维化[2]。补体C5a(过敏毒素)是补体激活过程中产生的一种强效的炎症介质，其通过与细胞表面特异性受体 (C5aR，一种G蛋白耦联受体)结合后诱发多种炎症反应[3]，研究表明，C5a通过上调C5aR mRNA的表达及激活转化生长因子（TGF-β1/CTGF）信号途径介导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞[4]，从而诱导肾间质纤维化，但C5a-C5aR的相互作用是否直接刺激人肾间质成纤维细胞（hRIFs）增殖、活化并生成细胞外基质尚不明确。本研究通过体外培养人肾间质纤维细胞，观察补体C5a-C5aR对细胞增殖及纤维化相关因子表达的影响，进一步探讨补体C5a的促肾纤维化作用的分子机制。
1.1 细胞来源 原代细胞培养的肾脏组织取自2019年2～6月经陕西省人民医院确诊的肾肿瘤患者，共收集4例（男性3例，女性1例），其中2例用于预实验，2例用于验证实验。本研究经我院医学伦理委员会审核批准。
1.2 试剂和仪器 RPMI-1640培养液（MRC公司），I型胶原酶（Sigma-vetec公司），抗vimentin抗体、抗desmin抗体、抗 fibronectin抗体、抗Collagen-I抗体及抗TGF-β1抗体（abcam公司），C5a纯品（hycult公司），C5aR拮抗剂（金斯瑞生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 hRIFs原代培养：选择肾肿瘤患者切除的肾脏组织，在远离肿瘤部分沿皮髓交界处切取髓质部分，行0.5mg/ml I型胶原酶溶解（30min，37ºC）经200μm过滤后，收集滤液于离心管中，1 000r/min离心10min。用RPMI-1640培养液洗涤1次，洗涤完后加入含0.1ml/ml灭活新生小牛血清的RPMI-1640培养液，悬浮细胞。37ºC CO2孵箱培育3天后换液，待细胞生成单层后，行1∶2扩增传代。
1.3.2 hRIFs细胞鉴定：体外培养第3代细胞铺满玻片,Tris 缓冲液漂洗 3 次,丙酮室温下固定玻片10～20 min; 滴加1滴Triton X-100 覆盖玻片表面,室温下静置1.0～2.0 h; 加vimentin蛋白一抗抗体或desmin蛋白一抗抗体, 室温下孵育1.0～2.0 h;加入异硫氢酸荧光素(FITC)标记的二抗,37℃孵育60min; 激光共聚焦显微镜下观察并拍照, 分辨率512×512, 阳性信号为绿色荧光。
1.3.3 hRIFs细胞C5aR受体检测：hRIFs细胞以1×105/瓶接种于培养瓶，无血清培养液孵育 24h，收集细胞，多聚甲醛固定, 滴加Triton X-100, 孵育 20min; PBS清 洗 3次，3%H2O2孵 育 20min，PBS清洗后封闭血清孵育60min。加入鼠抗人C5aR蛋白(1∶200)单克隆一抗抗体，4℃过夜。加入二抗,37℃孵育60min; DAB显色，苏木素复染10min，封片。细胞质或者细胞核中出现棕黄色或浅黄色染色即为阳性。
1.3.4 hRIFs细胞增殖实验：取第3代hRIFs细胞接种于96孔板培养24h，加入C5a纯品，结合课题组前期研究结果，浓度分别设为：0(空白对照)，10，15，20nmol/L刺激2，8，24h后收集细胞，每浓度设 3个复孔。分别于培养结束前6h加入MTS 10μl/孔,终止反应后加入二甲亚砜100μl/每孔,于560nm处测量A值，选择最佳刺激浓度和处理时间。
1.3.5 C5a纯品和C5aR拮抗剂处理后细胞外基质蛋白（ fibronectin，Collagen-I）及TGF-β1检测：取第3代hRIFs细胞接种于细胞培养板中,密度为3×103cells/L,培养24h后分别用C5a纯品和C5aR拮抗剂处理细胞（处理方法同1.3.4），提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，SDSPAGE分离蛋白，半干法转移至硝酸纤维素膜上，脱脂牛奶封闭2h，加入一抗, fibronectin(1∶250)，Collagen-I（1∶250），TGF-β1（1∶500），GAPDH作为内参，4℃过夜，加入相应二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔1∶2 000）,1h后进行DAB显色、扫描并使用image J软件进行灰度值分析、计算蛋白相对表达水平。
1.4 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行数据处理与统计分析，样本计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 hRIFs细胞形态学观察 经第1代培养的细胞在倒置相差显微镜下可见贴壁的组织块中有两种形态细胞长出，即立方形或多边形细胞和长梭形细胞，换液后，后者的生长速度明显大于前者，15天左右以长梭形细胞为主的细胞铺满瓶底，转种。此后每3天转种1次，转种2次后在即可获得均匀生长的含单个核的纯长梭形细胞。随后，运用细胞免疫荧光方法对该细胞进行鉴定，结果显示：hRIFs细胞vimentin蛋白表达阳性，desmin蛋白表达阴性，提示该细胞为hRIFs细胞，细胞形态和鉴定结果见图1。
图1 第3代肾间质成纤维细胞形态及免疫荧光鉴定结果
2.2 hRIFs细胞表达C5aR 见图2。因补体C5a必须与其受体C5aR结合后方可产生功能应答，hRIFs细胞是否表达C5aR尤为重要，本研究免疫组织化学结果显示hRIFs细胞表达C5aR。
图2 C5aR在hRIFs细胞上的表达(激光共聚焦显微镜,×200）
2.3 C5a纯品及C5aR拮抗剂刺激对hRIFs细胞增殖的影响 见表 1。MTS实验结果显示：与对照组相比，C5a纯品（浓度分别为10，15，20nmol/L）刺激后第2，8h 的A值差异无统计学意义 (P＞0.05),刺激后第24h的A值显著升高(t=4.891，4.211，8.408，均P＜0.05)。故选择C5a浓度为20nmol/L判断24h进行后续实验，与C5a纯品组相比，C5a纯品+C5aR拮抗剂组的A值明显降低，差异有统计学意义(t=8.657，P＜0.05)。
表 1 C5a对人肾间质纤维细胞增殖的影响（A值, ±s）
表 1 C5a对人肾间质纤维细胞增殖的影响（A值, ±s）
项目 空白对照 10 nmol/L组 15 nmol/L组 20 nmol/L组C5a刺激 2h 0.210±0.032 0.250±0.022 0.270±0.028 0.280±0.021 C5a 刺激 8h 0.223±0.0420 0.310±0.028 0.380±0.033 0.395±0.017 C5a刺激 24h 0.217±0.037 0.613±0.016 0.793±0.041 0.887±0.039 C5a+C5aR拮抗剂刺激24h 0.210±0.03 - - 0.424±0.016
2.4 C5a纯品及C5aR拮抗剂刺激后对细胞外基质蛋白（ fibronectin，Collagen I）以及 TGF-β1表达的影响 见表2。Western-Blot结果显示，与对照组相比，补体C5a（20nmol/L）刺激后第24h，fibronectin,Collagen-I以及TGF-β1蛋白表达水平都有明显增加，其结果具有统计学意义（t=4.891，5.820，2.311，均P＜0.05）。与C5a纯品组相比，C5a纯品+C5aR拮抗剂组 fibronectin,Collagen-I以及TGF-β1蛋白表达水平显著降低，结果具有统计学意义（t=2.349，1.618，3.774，均P＜0.05）。
表2 C5a及C5aR拮抗剂刺激后 fibronectin，Collagen-I及TGF-β1蛋白表达水平（灰度值）
肾脏疾病是继心脑血管病、糖尿病、肿瘤之后的又一严重威胁人类健康的疾病，而肾脏纤维化则是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭共有的病理损伤过程，因此深入认识肾脏纤维化的发病机制并找出对纤维化过程中起调节作用的关键途径具有重要的临床意义。补体活化产物 C5a是炎症反应趋化因子，具有过敏毒素样作用和强趋化作用，在炎症反应过程中起着重要的作用。C5a的作用主要通过与C5a受体的结合后激活C5aR的信号传导途径，引发级联反应，产生相应的功能应答，不同的靶细胞决定不同的应答途径，产生不同的生物学活性[4]。课题组前期发现补体活化在感染中对机体起有害作用，补体活化产生的片段C5a与其受体作用激活下游信号参与炎症调控[5]。慢性炎症反应可导致组织损伤和肾脏功能紊乱，最终导致肾间质纤维化[6]。
补体系统通过经典途径、MBL途径、旁路途径三条途径激活，传统观点认为补体激活途径是以C3激活为起点，进一步激活C5后诱发补体级联反应。研究通过C3基因敲除小鼠发现，免疫复合物在C3基因敲除小鼠中依然能够激活级联反应，使C5为一条新的补体激活途径[7]。C5a是肾脏疾病中新型的促纤维化因子，是肾小管间质纤维化新的治疗靶点，激活过程中会产生促炎的补体成分C3a，C5a，参与多种肾脏疾病的发病过程。在阿霉素肾病中,肾脏局部可产生C3,经C3裂解形成 C3a，C5a等补体成分,共同参与肾小球和肾小管的损伤[8]。LIU等[9]研究发现，在C5a小鼠处理组中α-SMA，E-cadherin，Col-I，TGF-β1和CTGF的表达明显高于对照组，而C5aR拮抗剂抑制了α-SMA，E-cadherin，Col-I，TGF-β1和 CTGF的表达，即C5a-C5aR的相互作用激活TGF-β1和CTGF信号途径介导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞。大鼠UUO模型中提示肾脏组织中C5aR的表达在早期随着梗阻时间延长而上调，晚期则增多缓慢，其基因水平表达情况同蛋白基本一致，提示C5aR可能在肾脏局部通过与循环系统中的C5a结合在肾间质纤维化早期起作用[10]。研究显示，C5a-C5aR直接作用于HK2细胞可诱导IL-17的产生,在肾移植后的排斥反应中起重要作用[11]。同时，在系统性红斑狼疮的发病机制中，补体也扮演着非常重要的角色，C3，C4 通常被作为 SLE 的诊断和活动度的判别指标之一[12]。
目前关于C5a-C5aR信号转导通路有一定的研究，主要通过3种信号通路传递信号：①具有调节丝裂素激活的蛋白激酶（MAPK)信号通路；
②肌醇磷脂-磷脂酶C（PI-PLC）信号通路；
③环磷腺苷(cAMP)信号通路。HU等[13]的研究表明,补体抑制剂通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinase B, AKT)信号改善肾缺血-再灌注损伤。CHEN等[14]的研究提示,单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化过程中可溶性IL-6受体水平升高，用Fc-gp130阻断IL-6反式信号可降低肾组织的炎症水平、免疫细胞浸润和促纤维化细胞因子的表达,降低信号转导及转录激活蛋白3 (STAT3)的磷酸化,减少肾组织中成纤维细胞的积聚。LIU等[15]研究表明C5aR能与Gai 和Ga16偶联，激活Ras-Raf-MEK-ERK信号途径。用C5aR抗体封闭C5aR，阻断了C5aR相联系的MAP激酶信号PKC-8MEK-1和p44/p42 MAPK等级联反应，表明C5aR通过PKC相联系的 MAPK信号通路起作用。本研究通过体外培养hRIFs，证实了hRIFs表达C5a受体，同时，发现C5a刺激后，hRIFs细胞增殖显著，促纤因子TGF-β1和细胞外基质蛋白 fibronectin，Collagen-I明显增加，而加入C5aR拮抗剂后，以上蛋白表达则明显抑制，进一步证实C5a-C5aR相互作用可直接刺激肾间质纤维细胞增殖，从而诱导肾间质纤维化，但研究具有一定的局限性,未能探讨补体 C5a通过何种信号通路调控细胞增殖及促纤因子的释放,今后将进一步的完善体内和体外实验。
综上所述，本研究为肾间质纤维化的发病机制提供了崭新视角，以补体C5a受体为靶点的药物研究日益受到重视，C5aR拮抗剂可望成为一种肾脏疾病防治的新手段和干预靶点。
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