袁冬冬 温艳艳 何慧丽 聂志勇 洪永贵 吴 涛
胃癌(gastric carcinoma，GC)是常见的消化系统恶性肿瘤，是一种高发病率、高死亡率的消化系统恶性肿瘤，起源于胃黏膜上皮，具有早期诊断难、晚期难治疗的特征[1-2]。有研究称胃癌的预后与患者淋巴结转移、TNM分期、病理类型、肿瘤浸润深度等有关[3-4]，但是无法在患者早期患病时轻松获取此类信息，因此需要寻找对胃癌患者的预后做出准确评估的新型生物学标志物。近期有研究发现胃癌的发生发展与自噬活性的改变有关，且自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和自噬相关基因-5(autophagy related gene-5，ATG5)均是参与自噬活性调控的重要基因[5-6]。在多种被发现的 lncRNAs 中，SATB2 反义RNA 1(SATB2 antisense RNA 1，SATB2-AS1)定位于2q33.1 区域，为 SATB2 的天然反义 lncRNA，最早被报道为一种在骨肉瘤中发挥致癌作用的lncRNA，能在体外促进细胞增殖、生长和细胞周期进程[7-8]。因此，本研究探讨胃癌组织中LC3、ATG5和SATB2-AS1在不同部位表达与临床病理特征及预后的相关性，在临床中具有重要的研究价值。
1.1 研究对象
选取2018年5月至2019年10月本院收治的胃癌患者50例，年龄38～77岁，平均(67.32±7.64)岁。纳入标准：①符合《胃癌规范化诊疗指南(试行)》[9]中关于胃癌的诊断标准，患者经病理检查确诊为胃癌；
②行根治术或姑息术切除肿瘤，且术前未接受过放化疗、免疫治疗患者；
③所有患者病理组织均可进行免疫组织化学检测；
④患者签署自愿受试同意书，患者及其家属需签署知情同意书。排除标准：①合并其他器官严重性病变患者；
②合并其他恶性肿瘤患者。
1.2 免疫组化法检测LC3和ATG5表达
获取手术完整切除的胃癌组织，经固定、脱水、包埋、切片，由病理科医师选定蜡块。将包埋制作好的组织芯片蜡块切成3～5 um的薄片，烘片后置于二甲苯中20 min，经无水乙醇、90%、80%、70%梯度乙醇清洗，ddH2O清洗后，3%H2O2溶液浸泡，PBS浸泡后加封闭液37 ℃封闭1 h。PBS浸泡后加一抗，4 ℃孵育过夜。PBS浸泡后加二抗，室温孵育1 h，PBS浸泡清洗后加DAB显色。ddH2O漂洗后苏木精衬染后自来水冲洗玻片，65 ℃烘干后中性树胶封固。结果判定：应用Dmetrix 扫描系统扫描成数字切片，采用双盲法阅片。在低倍镜(100×)、高倍镜(400×)下观察癌周与癌巢部位染色强度，细胞核呈棕黄色颗粒为阳性。根据阳性细胞百分比计分：无阳性细胞数为0分，<10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分。其中低表达为0～1分，高表达为2～3分。
1.3 RT-PCR检测SATB2-AS1表达
采用TRIzol提取组织中总RNA，选取500 ng总RNA与2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)混匀后进行逆转录反应，随后取扩增产物行qPCR，25 μl反应体系包含TB GreenFast qPCR Mix(2×)12.5 μl、上下游引物各1 μl、DNA模板2 μl和灭菌水8.5 μl，反应条件:预变性95 ℃ 30 s，40个循环的95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s，整个qPCR操作于ABI 7300实时荧光定量PCR上完成。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt表示SATB2-AS1的相对表达量。SATB2-AS1上游引物：5"-GAGGAG-CAGGGGGTAGAGAA-3"，下游引物:5"-GTGTCAC-CCAACCTCTCCTG-3"；
GAPDH上游引物:5"-GTAT-GACTGGGGGTGTTGGG-3"，下游引物:5"-AGCCACACCATCCTAGTTGC-3。
1.4 随访
收集患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤最大径等临床资料。采用电话及门诊或住院复查等方式进行随访，了解患者生存情况。随访时间截止2021年5月。根据随访结果将患者分为死亡组和生存组。
1.5 统计学分析
2.1 胃癌中LC3、ATG5和SATB2-AS1在癌周和癌巢表达与临床病理特征的关系
胃癌中LC3在癌周和癌巢表达与患者肿瘤分化程度、淋巴结转移情况有关(P<0.05)；
ATG5在癌周表达与患者肿瘤分化程度、肿瘤分期有关(P<0.05)，ATG5在癌巢表达与肿瘤分化程度、肿瘤分期和淋巴结转移情况有关(P<0.05)；
SATB2-AS1在癌周表达与患者肿瘤分化程度、肿瘤最大直径有关(P<0.05)，SATB2-AS1在癌巢表达与患者肿瘤分化程度、肿瘤最大直径和临床分期有关(P<0.05)。见表1～3。
表1 胃癌中LC3在癌周和癌巢表达与临床病理特征的关系
表2 胃癌ATG5在癌周和癌巢表达与临床病理特征的关系
表3 胃癌中SATB2-AS1在癌周和癌巢表达与临床病理特征的关系
2.2 影响胃癌患者预后的单因素分析
随访至2021年5月，50例患者死亡23例。单因素分析发现分化程度、淋巴结远处转移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表达是影响胃癌预后的因素(P<0.05)，见表 4。
表4 影响胃癌患者预后的单因素分析/例
2.3 影响胃癌患者预后的多因素分析
多因素分析显示肿瘤分化程度、淋巴结远处转移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表达是影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)，见表5。
表5 影响胃癌患者预后的多因素分析
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，发生率与死亡率分别位居全球第5位与第3位[10]。我国胃癌发病率与死亡率仅次于肺癌，居第2位，是造成社会负担的重要因素，多数患者因中晚期胃癌就诊[11-12]。胃癌的主要临床表现为远期生存状况低下、临床治疗效果差，且具有易复发、易转移的特点[13]。尽管近年来晚期胃癌患者手术及放化疗方案不断发展，但是5年生存率仍然较低[14]。针对表皮生长因子受体、c-met等药物正在进行临床试验，但是胃癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程，在胃癌中的应用存在局限性[15-16]。另外关于胃癌发生发展和转移的分子机制尚不清楚，因此探讨胃癌的发生、发展、浸润、转移及复发等过程的作用机制，寻找新的预后指标是目前临床研究亟待解决的问题。
LC3 是酵母 Atg8p 的哺乳动物同源物，被认为是自噬体的重要组成部分[17]，包括 LC3A、LC3B、LC3C 3种同工型，其中 LC3B 与自噬水平相关[18]。LC3 已被发现在多种肿瘤包括卵巢癌、脑癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤中异常表达[19-20]。LC3 表达与FIGO 分期相关[21]。
LC3 表达与血管浸润显著相关；
高 LC3 表达表明总体生存率 (OS) 较差[22-23]。ATG5是一种重要的自噬体形成相关蛋白，在真核细胞中充当 E1 样激活酶[24]。ATG5 已被证明在病毒感染、肿瘤细胞凋亡和肿瘤增殖中起到重要作用，有望成为临床癌症治疗的新靶点[25-26]。LncRNA 是一类长度大于 200 个核苷酸且没有蛋白质编码能力的转录子[27]。越来越多的研究数据表明，lncRNAs是基因表达的重要调节因子，参与多种生理和病理过程，包括肿瘤的发生和发展[28]。有研究发现了一种新的 lncRNA，SATB2-AS1在结直肠癌中的表达水平显著降低，并且与结直肠癌的预后相关[29]。有研究发现SATB2-AS1可以抑制结直肠癌转移并调节结直肠癌细胞中TH1型趋化因子的分泌[30]。本研究发现虽然癌周组织中LC3、ATG5和SATB2-AS1的表达和患者的预后不存在相关性，但与临床病理特征有关，提示癌周组织中LC3、ATG5和SATB2-AS1表达参与胃癌的发生发展过程。本研究中癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表达与患者预后存在相关，即高表达的患者的生存率更低，癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表达是影响胃癌预后的独立危险因素，提示癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表达有潜力成为预测胃癌患者预后的生物标志物，但其中具体作用机制尚不明确，潜在的原因还需进一步试验数据来验证。
综上所述，本研究胃癌癌周和癌巢组织中LC3、ATG5和SATB2-AS1表达与临床病理特征存在相关性，癌巢组织LC3、ATG5和SATB2-AS1表达可作为预测胃癌患者预后的生物标志物。
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