李元元，王彩虹，生 宁，马聪玉，张金兰
(中国医学科学院药物研究所，北京 100050)
中药药代动力学是研究中药活性成分或指标成分在体内吸收、分布、代谢和排泄的动态变化规律，与药效学结合诠释中药的安全性和有效性，为中药发挥药效的物质基础、作用机制、复方组方原理及中药传统理论的科学阐释提供依据，是诠释中药理论和机制的桥梁学科。由于中药成分的复杂性及药效物质尚不明确，其药代动力学研究存在诸多困难，如中药化学组成复杂、体内代谢途径多样、体内成分结构鉴定和代谢途径诠释困难；
中药药效成分不明使药代动力学研究的目标成分不明确，且目标成分在生物样本中的浓度低、内源性基质和目标成分之间干扰大、中药成分及其代谢产物对照品有限，使中药多成分检测和定量分析方法的建立存在困难。
随着分析技术的快速发展，研究人员通过探索并开发适合中药多成分分析的新技术，有力地推动了中药多成分药代动力学研究，实现了体内中药多成分高效、全面的定性分析和灵敏、快速、准确、宽动态范围的定量分析。本文将对近10年来中药药代动力学研究的分析技术发展及应用进行综述。
生物样本的前处理技术主要包括提取、分离与富集，以达到提高分析灵敏度和准确度，同时降低基质干扰的目的[1]。在中药多成分药代动力学研究中，给药液自身的复杂性和所采集生物样本中内源性物质、中药原型成分及代谢产物的复杂性等都对生物样本前处理技术提出了更高的要求。中药药代动力学研究采集的生物样本通常包括体液(血浆、血清、尿液、胆汁等)和组织器官(心、肝、脑、肠等)，前处理方法主要有蛋白沉淀法、液-液萃取法和固相萃取法[2]。由于生物样本的基质复杂、中药待测成分含量低且不易提取，研究人员需要针对具体生物样本和待测目标成分的理化性质系统地优化并选择适合的前处理技术。另外，针对特定化合物的理化性质还需采用特殊的方式，如黄芩苷和黄芩素在生物样本中易发生氧化，需要在样本采集后加入抗坏血酸进行保护[3-4]。针对生物样本中不稳定成分采用的稳定剂列于表1。
表1 生物样本中不稳定成分采用的稳定剂Table 1 Stabilizers for unstable components in biological samples
1.1 常用前处理技术
1.1.1蛋白沉淀法 蛋白沉淀法(protein precipitation,PPT)适用于含药浓度较高的生物样本，具有操作简单、设备要求不高等特点，主要用于血浆和组织样本的前处理，常用的有机溶剂包括乙腈、甲醇和乙醇等，将不同有机溶剂按不同比例混合能够影响生物样本中蛋白的变性和沉淀过程，从而影响化合物的提取回收率。例如，Chen等[14]使用含不同比例乙醇的乙腈蛋白沉淀法比较了大鼠血浆和组织样本中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸等15种中药火炭母成分的提取效率，发现当乙醇与乙腈体积比为1∶1时，各成分的提取回收率最佳，均大于80%，实现了大鼠给药火炭母提取物后多成分血浆药代动力学和组织分布研究。
1.1.2液-液萃取法 液-液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)的优点在于其具有较高的选择性，可通过使用不同的萃取溶剂选择性去除生物样本中的干扰物质。但该方法难以应用于多个极性差异较大化合物的同时提取，必要时需采用多步液-液萃取法。例如，尼莫地平和银杏叶提取物联用对血管性痴呆患者具有较好的临床疗效，但银杏叶提取物的主要活性成分黄酮类化合物在体内以苷元、葡萄糖醛酸化代谢物和硫酸化代谢物3种形式存在，与尼莫地平的极性差异较大。基于此，Xiao等[15]开发了两步萃取法，即先用正己烷-乙醚混合溶剂提取大鼠血浆中的尼莫地平，剩余残渣经酸水解，将黄酮的葡萄糖醛酸化代谢物和硫酸化代谢物转化为黄酮苷元后，再用乙酸乙酯充分提取，实现了大鼠血浆中尼莫地平和银杏叶提取物多成分的同时定量分析。实验结果表明，与单药给药相比，联用给药不会改变尼莫地平或银杏叶提取物成分在大鼠体内的药代动力学行为，为联用给药剂量和方案的制订提供了数据支持。
1.1.3固相萃取法 固相萃取法(solid phase extraction,SPE)在降低内源性物质干扰、减少基质效应方面极具优势。通常采用商品化的固相萃取小柱，按其所用填料主要分为反相填料[16](硅胶键合C4、C8、C18和Phenyl)、正相填料[16](硅胶键合Si-CN、Si-NH2和Si-Diol)、离子交换填料[17](硅胶键合Si-WAX、Si-SAX、Si-SCX和Si-WCX)以及混合型填料[18](分子印迹聚合物和分子印迹膜)，一般需依据分析物的极性、溶解度、解离常数(pKa)等理化性质选择合适的固相萃取柱。Zheng等[19]开展了益气复脉粉针剂在心力衰竭大鼠体内的药代动力学研究，使用甲醇或乙腈蛋白沉淀法，以及乙酸乙酯、氯仿或正丁醇液-液萃取法均无法排除大鼠血浆中内源性物质对人参皂苷类成分的基质干扰，且提取回收率较低；
而采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱前处理后可使基质效应符合要求，各人参皂苷类成分的提取回收率大于60%，实现了益气复脉粉针剂给药后大鼠血浆中10种人参皂苷类成分的准确定量。
近年来，随着新型固相吸附剂的开发，固相萃取小柱得到了较快发展。从传统的反相固相吸附剂发展到两亲性固相吸附剂(同时具备非极性和极性官能团)，其可以保留极性至非极性化合物，适用于理化性质差异较大的中药多成分前处理要求。同时，为适应生物样本的大规模、平行、快速处理，高通量固相萃取板和集成式全自动固相萃取仪相继产生，并出现了一些无需活化和平衡的“快速”固相萃取小柱(例如，默克SupelTMSwift HLB小柱)，极大地提高了中药多成分药代动力学研究的分析通量。
1.2 微萃取技术
除常规PPT、LLE和SPE外，一些新型的生物样本前处理技术不断涌现。微萃取技术具有高通量、消耗样本量和溶剂量小等特点，主要包括固相微萃取技术(solid-phase microextraction,SPME)[20]、搅拌棒吸附萃取技术(stir bar sorptive extraction,SBSE)[21]、填充吸附剂微萃取技术(microextraction by packed sorbent,MEPS)[22]和单滴微萃取技术(single drop microextraction,SDME)[23]等。微萃取技术的最大优势在于集生物样本分离、富集、浓缩于一体，可与分析仪器直接联用，极大地提高了样品的前处理效率。同液相色谱相比，微萃取部件更容易直接与气相色谱进样口端嵌和连接。例如，Deng等[24]通过优化纤维涂层种类、样品温度、萃取时间、搅拌速度等关键参数，建立了适用于兔血浆中细辛醚提取和富集的顶空固相微萃取-气相色谱联用技术，整个样品的前处理仅需20 min，且无需有机溶剂，高效快速地表征了兔口服石菖蒲挥发油后血浆中细辛醚的药代动力学。但与常规的前处理技术相比，微萃取技术需要实验前期繁复的条件摸索和优化，对操作人员的要求较高，限制了其广泛应用。
1.3 微透析技术
中药药代动力学研究常用的取样方法主要是在给药后不同时间点取动物全血或动物组织进行匀浆，采集的生物样本通常要经过分层、离心、萃取、过滤等繁琐的前处理操作。微透析(microdialysis)作为一种生物活体取样技术，基于扩散的分离原理将带有半透膜装置的探针植入生物体内，在非平衡条件下只有游离的小分子药物能沿浓度梯度扩散至探针，并被灌流液不断带出，得到含有药物的透析液，操作流程示于图1。由于该技术使用的半透膜只允许小分子物质透过，大分子蛋白和脂类物质则被截留，因此透析液可以不经前处理直接测定。除此之外，微透析技术可以实现单个或多个部位的连续实时采样，降低实验动物体液损失、减少动物个体差异对结果的干扰[25]，该技术已应用于中药多成分体内分析研究。例如，Fu等[26]经微透析采样，结合液相色谱-三重四极杆质谱联用技术比较了正常大鼠和阿尔茨海默症模型大鼠的血浆和脑脊液中10种木脂素类成分的药代动力学差异，发现阿尔茨海默症病理状态能够显著改变木脂素类成分在大鼠体内的药代动力学行为，提示研究人员应充分关注疾病状态对中药多成分药代动力学的影响。欧咏[27]在大鼠血管、肝脏、膝关节多部位同时植入微透析探针，可同时动态监测中药复方三妙丸给药后小檗碱在大鼠血、肝脏和膝关节中的浓度。微透析技术的另一优势在于其可与分析仪器直接联用，提高实验效率且避免前处理过程中的交叉污染和操作误差。例如，Wang等[28]研发了在线联用的接口装置，实现了微透析实时取样与超高效液相色谱-串联质谱的联用，并将其应用于慢性脑缺血大鼠给药刺五加提取物后6种主要活性成分在脑内的药代动力学研究，同时监测脑内神经递质的动态变化规律，阐明了刺五加提取物活性成分透过血脑屏障的能力和对神经递质的调控作用。
图1 微透析技术示意图Fig.1 Schematic diagram of microdialysis technique
1.4 样本自动化前处理技术
中药药代动力学研究常需要对大批量样本进行前处理，快速、准确和自动化的前处理技术不仅能够提高检测通量，还有助于减少人为过程的影响。目前，多家公司已经研发出专门用于蛋白沉淀法和固相萃取法的96孔板和固相萃取系统，如Waters公司的Sirocco蛋白沉淀板、Oasis固相萃取板和配套的96孔正压提取装置，Agilent公司的Captiva蛋白沉淀板和Bond Elut固相萃取板，Thermo公司的HyperSep蛋白沉淀板和HyperSep-96固相萃取装置等；
另外，在线固相萃取、固相微萃取和微透析技术也渐趋成熟。自动化的前处理技术极大提高了中药生物样本的前处理通量，如Tao等[29]以甲醇和乙酸乙酯为洗脱溶剂，采用Waters Oasis HLB μElution 96孔固相萃取板对大鼠灌胃给予麝香保心丸后的血浆样本进行前处理，结合液相色谱-质谱联用技术研究9种人参皂苷和7种蟾蜍二烯羟酸内酯成分的药代动力学特征；
Pascale等[30]采用Agilent Captiva EMR-Lipid 96 孔蛋白沉淀板用于人口服5种姜黄提取物制剂后血浆样本的前处理，结合液相色谱-质谱联用技术研究姜黄素及其主要代谢产物的药代动力学特征，实现了生物样本的高通量分析。
中药体内成分和代谢物分析具有成分复杂、干扰多、含量低、浓度变化动态范围宽和数据处理工作量大等特点，需要分离效能高、灵敏度高、选择性好的分析技术。
2.1 色谱分析技术
2.1.1高效液相色谱法 高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)是目前中药药代动力学应用最广泛的分离技术，能够分离极性、离子化、不易挥发和热不稳定的化合物，具有分离效能高、适用范围广、选择性好的特点。为进一步缩短高效液相色谱的分析时间，提高分离效率，超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)逐渐得到应用，其基于HPLC原理，采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2 μm)和超高压系统(压力大于105 kPa)，具有分离效率更高、分析速度更快、重现性更好等优点，在中药及中药生物样本的分析中发挥了巨大的优势[31]。Wei等[32]采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱技术同时测定比格犬灌胃给药补骨脂提取物后血浆中的10种活性成分，研究补骨脂提取物中多成分药代动力学特征，在保证待测的2对同分异构体达到基线分离的同时，每个样本的分析时间仅需8.5 min，该方法适用于大样本量的药代动力学分析。
根据流动相与固定相极性的差别程度，将高效液相色谱分为反相液相色谱(reversed phase liquid chromatography,RPLC)和正相液相色谱(normal phase liquid chromatography,NPLC)。RPLC是目前应用最广的色谱分离技术，它能与各种常规的检测方法结合，解决多种分析问题，但对极性和亲水性化合物却很少或无法保留。采用NPLC法分析极性和亲水性化合物同样存在局限性。亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)采用极性固定相和高比例有机相-水的流动相。近年来，HILIC受到越来越多的关注[33-35]：一方面是对强极性和亲水化合物有很好的保留和分离选择性，与反相色谱有很好的互补性，同时，使用的流动相体系相对简单，克服了正相色谱流动相对水溶性物质溶解性差、与质谱检测器不兼容的问题。另一方面是因为强极性化合物的分离引起各研究领域的关注，如代谢组学、药物分析等；
氨基、酰胺基、氰基、二醇基等都是亲水相互作用色谱常见的键合相类型，实验时可依据待测成分性质进一步优化色谱柱类型。Sun等[36]在开展中药乌头活性成分附子宁碱在大鼠血浆中的药代动力学研究时发现，附子宁碱在反相色谱柱上几乎无保留(保留时间小于2 min)，而使用键合有聚丙烯酰胺的HILIC色谱柱后，附子宁碱可与血浆中其他干扰物质有效分离，能够满足药代动力学研究的要求。
经典的一维色谱分离有时存在峰容量低和峰重叠等问题，难以实现中药及其代谢物全组分的准确定性和定量。而二维液相色谱通过2个不同分离模式的色谱柱分离样品，显著提高了系统峰容量和分离度[37]，成为分离中药复杂样品的有效工具。针对中药莪术提取物在常规一维液相色谱分离时存在色谱峰重叠、基线干扰、成分鉴定少的问题，Zhou等[38]建立RPLC×RPLC-Q-TOF/MS分析方法，第一维采用苯基/四唑硫醚(PTAS)键合相色谱柱，第二维采用C18色谱柱，两者的正交性可达93.2%，从莪术提取物中识别出439个色谱峰，鉴定出105种成分，其中有73种成分尚未见文献报道，解决了莪术成分表征不充分的问题。但受限于二维流动相兼容性差、阀切换过程样品丢失和多维数据处理困难等技术瓶颈，尚未见二维液相色谱在中药多成分药代动力学中的应用，但其提供的全新分析模式值得借鉴。
2.1.2气相色谱法 气相色谱(gas chromatography,GC)与质谱联用后用于中药挥发性成分的分析，具有分离效率高、灵敏度高和通量高的特点。电子轰击离子源(EI源)是气相色谱-质谱联用仪最常用的电离源，其性能稳定、碎片重现性好、特征性强，且有成熟的化学物质标准谱库(如NIST和Wiley数据库等)可供检索。目前，气相色谱工作站均搭载了上述化合物标准谱库，极大地提高了化学成分结构鉴定的效率和准确度。Lan等[39]采用气相色谱-质谱法结合NIST 14标准谱库快速表征了莪术药材中40种挥发油成分，与聚类分析相结合实现了来源于5个产地共30批莪术药材的区分和质量评价。气相色谱-质谱技术同样适用于分析中药生物样本中的挥发性成分，如Fan等[40]采用气相色谱-质谱技术表征了大鼠口服细辛提取物后血浆中挥发性成分黄樟素和甲基丁香酚的药代动力学特征；
Wang等[41]基于气相色谱-质谱技术研究了石菖蒲挥发油给药后大鼠血浆中4种挥发性苯丙素类成分的药代动力学特征。
2.2 质谱分析技术
2.2.1质谱离子化技术 中药多成分药代动力学要求尽可能多的分析中药原型成分及代谢产物，因此要求质谱能够同时电离不同种类和结构的化合物，给离子化技术带来了挑战。电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)[42]和大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)[43]是近年来液相色谱-质谱中的主流离子化技术。ESI通过液滴的形成、去溶剂化和气相离子的形成，使非挥发性溶液相离子转为气相，适合分析极性化合物和生物大分子。APCI是在大气压下以试剂离子和靶分子之间的电荷转移为基础，对产生的靶离子进行质量分析，其对ESI源难以电离的弱极性化合物有较好的电离能力，与ESI源优势互补。羽扇豆醇是中药中广泛存在的一种活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、促进创面愈合等药理作用，但其为五环三萜类成分，分子结构中缺少发色团，难以应用紫外检测器检测，且分子极性弱，ESI源电离效率低。因此，Khatal等[44]基于APCI源，使用UPLC-MS/MS技术成功表征了大鼠给药羽扇豆醇后的血浆药代动力学。
电子轰击电离(electron impact,EI)和化学电离(chemical ionization,CI)是气相色谱-质谱中常用的电离方式。在一定能量的电子作用下，EI将易挥发的样品分子电离，使其聚焦成离子束进入质量分析器，可获得丰富的化合物碎片信息，谱图重现性好。Li等[45]采用 Agilent 7890B气相色谱系统联用配备EI源的 Agilent 5977A质谱系统，建立了同时测定大鼠口服姜黄精油后血浆中7种主要活性成分的定量方法，与Ji等[46]采用的HPLC-MS/MS方法相比，目标化合物的检测灵敏度提高了7～21倍。CI通过反应气试剂电离产生活性反应离子，与样品发生离子-分子反应实现样品分子的电离，常用的反应气试剂有甲烷、异丁烷、氨气等。对于EI源下不稳定的化合物，CI源能够获得丰度较高的分子离子峰信息。例如，合成代谢类固醇是一类在结构及活性上与人体雄性激素睾酮相似的化学合成衍生物，EI源产生的分子离子峰丰度低，难以获得化合物的分子质量信息。Polet等[47]以氨气作为反应气，采用GC-CI-MS技术测得3种不同结构类型的合成代谢类固醇分子离子峰，并结合碰撞诱导解离(collision-induced dissociation,CID)获得这些化合物的特征碎片离子，总结不同类型合成代谢类固醇质谱的特征碎片与结构之间的关系。但由于CI谱图的重现性不如EI，而且没有标准谱库，尚未见将其应用于中药药代动力学研究的报道。
常压离子化技术以解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization,DESI)和实时直接分析(direct analysis in real time,DART)为代表，具有样品前处理过程简单，可以进行实时和原位分析的特点。Wei等[48]建立了LC-MS/MS法结合DESI技术监测人参皂苷Rg1在大鼠肝、肾、肺、脑等多个组织中的分布情况，通过DESI成像将人参皂苷Rg1在不同组织中的空间分布可视化，直观地表征了Rg1在大鼠体内的代谢轮廓。Li等[49]应用DART技术识别和鉴定乌头碱、中乌头碱和次乌头碱在大鼠肠内菌中的36种代谢产物，整个分析过程无需样品前处理，单个样品的分析时间少于10 s。与传统的离子化方式相比，常压离子源具有一定的优势，但其在灵敏度和重现性等方面还存在不足，限制了在中药药代动力学的应用。
质谱成像技术(mass spectrometry imaging,MSI)是将质谱的离子扫描过程与专业图像处理软件结合，对样本表面的化学组成、相对丰度和空间分布进行全面、快速分析，可以原位反映内源性物质及外源性物质的种类、浓度和空间分布信息，便于药代动力学的深入开展，质谱成像示意图示于图2。Tan等[50]采用MSI技术研究紫杉醇在猪腹膜组织上的浓度和空间分布，为紫杉醇在靶向治疗腹膜癌症方面提供有效信息。光学显微镜与质谱仪的联用不仅可以获得组织切片图像，还可以获得药物与代谢产物的空间分布信息，并且能够区分两者，获得分子结构信息[51]。Wang等[52]采用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(MALDI-MSI)获得小鼠肾组织切片中灯盏乙素及其代谢产物的原位空间分布图，发现灯盏乙素及其脱糖苷化代谢产物(野黄芩素)分布在肾脏皮质和髓质区域，丰度相对较高，而其余代谢产物则分布在肾脏皮质中，丰度较低。虽然质谱成像技术有诸多优势，但其在中药药代动力学的应用仍存在许多限制，如背景基质干扰、很难准确定量和图片分辨率低等问题。
图2 MALDI质谱成像示意图Fig.2 Schematic diagram of MALDI mass spectrometry imaging
2.2.2质量分析器及质谱联用技术 通常按照质量分析器的不同对质谱仪进行划分，包括四极杆(quadruple,Q)、离子阱(ion trap,IT)、飞行时间质谱(time of filght,TOF)、傅里叶变换-离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FT-ICR)、轨道阱(Orbitrap)以及将不同类型的质量分析器串联起来的复合式串联质谱。在中药药代动力学研究领域，具有多反应监测功能的三重四极杆质谱(QqQ)是中药定性鉴定和定量测定不可缺少的工具[53-55]，而离子阱质谱的多级串联功能和四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)的高分辨及串联功能可为中药代谢物的结构表征提供重要信息[56]。此外，离子回旋共振及轨道阱质谱得到的精确质量数将提供准确的元素组成信息，可以进一步确证中药未知代谢物的结构。
Fu等[57]建立了液质联用分析方法研究急性痛风性关节炎模型大鼠单独和同时灌胃给予白术和黄柏提取物后的血浆药代动力学特征，诠释了中药二妙丸中白术和黄柏治疗急性痛风性关节炎的协同作用机制。此外，质谱还可以与其他分析技术联用，如紫外光谱、核磁共振、圆二色谱等，其中液相色谱-核磁共振-质谱(LC-NMR-MS)联用技术由于能够提供更丰富的结构信息，被越来越多地应用于中药微量代谢产物的结构鉴定。Su等[58]首先采用LC-MS/MS技术初步识别和鉴定大鼠胆汁中异巴伐查酮的15种代谢产物，再通过LC-NMR-MS技术确定代谢产物的取代基位置。但由于核磁共振对13C的灵敏度很低，目前只能做1H核磁共振，这样会导致化合物结构信息的缺损；
另外，采用溶剂信号抑制技术会丢失与溶剂峰有重叠的目标化合物的部分结构信息。
分析技术的进步有力地推动了中药多成分的药代动力学研究，为中药物质基础和机制研究拓展了可行手段，但依然需要突破一些关键的瓶颈。例如，如何建立中药体内多成分药代动力学数据与中药药效的关联分析策略，识别中药药效物质；
如何以药代动力学数据为指导开展后续的中药药效成分验证实验，以及更深入的中药药效成分作用机制研究。前处理技术和分析技术的不断创新发展对中药药代动力学的深入研究不可或缺，未来将为中药多成分药代动力学研究提供更多的技术支撑，为更全面、更清晰地阐明中药物质基础和药效机制奠定基础。