谢俊俊，陈海清，尹伟
1.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330029；
2.合肥职业技术学院，安徽 合肥 238010
乌饭树（Vaccinium bratetum）Thunb.为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属常绿灌木，在我国江西、湖南、湖北、安徽及广东等地广泛分布，其树叶中含有广泛的营养成分和药物活性成分。有研究表明［1］，乌饭树叶中的营养成分和药物活性成分在抗疲劳、延缓衰老、增强免疫力、抗氧化、抗菌、抗病毒等方面有明显作用，尤其是乌饭树叶总黄酮在抑制肿瘤方面具有较好的应用前景［2］。本研究采用响应面分析方法优化乌饭树叶总黄酮的提取工艺，并考察了其体内抗肿瘤活性，旨在发现乌饭树叶的药用价值。
1.1 材料与试剂
乌饭树叶（干燥品，购自樟树市药材市场，经安徽中医药大学王道群教授鉴定其为乌饭树叶），芦丁对照品（青岛泰东制药有限公司，批号：10082-2021707），乙醇（分析纯，东莞市勋业化学试剂有限公司）。4T1（小鼠乳腺癌细胞）荷瘤小鼠（BALB/c）、A549（人肺癌细胞）荷瘤小鼠（BALB/c）（安徽盛鹏实验动物科技有限公司）。甲氨蝶呤（湖北兴银河化工有限公司）。
1.2 仪器与设备
紫外分光光度计（上海默威生物科技有限公司）、电子天平（江苏金坛三金实验器材有限公司）、BK 型超声波萃取器（纳博科超声波有限公司）、离心机（浙江三联环保科技公司）。
2.1 标准曲线绘制
将芦丁对照品在120 ℃干燥至恒重，精密称定10.0 mg 置100 mL 量瓶中，用80%乙醇溶解并定容至刻度，精密量取上述对照品溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置于25 mL 量瓶中，室温静置20 min，最终浓度分别为：0 mg/mL、0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.020 mg/mL。标准曲线方程纵坐标为吸光度（y），横坐标为芦丁对照品浓度值（x），回归方程为：y=13.32x-0.64（r=0.999 7），线性浓度范围为：0～0.020 mg/mL。
2.2 乌饭树叶总黄酮提取工艺及含量测定
乌饭树叶冷风干燥后粉碎过200 目筛，精密称取一定量的粉碎样品置100 mL 烧瓶中，加入适量80%乙醇，用超声波萃取器进行加热回流、超声萃取、抽滤，充分提取3 次［3］，所得提取液在3 000 r/min下离心，取上清液定容，室温放置20 min，用紫外分光光度计测定提取液吸光度，计算总黄酮含量和提取收得率。
3.1 提取单因素实验及结果
3.1.1 提取时间的影响恒定提取工艺中的超声功率和液料比，考察不同提取时间对总黄酮含量的影响，考察的提取时间分别为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min。从图1（A）可见，总黄酮含量在120 min 时达到峰值，总体表现为先升后降趋势；
总黄酮含量在提取120 min 后开始下降，可能为其发生了降解，且降解速度与提取时间呈现正比关系［4］。
3.1.2 液料比的影响恒定提取工艺中的提取时间和超声功率，考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）与总黄酮含量之间的关系。从图1（B）可见，当液料比在40∶1 时，总黄酮含量达到峰值后，持续增加提取溶剂的比例，乌饭树叶总黄酮含量并未持续增加。
图1 各单因素实验对乌饭树叶总黄酮的影响：A.提取时间；
B.液料比；
C.提取超声功率：
3.1.3 超声波功率的影响恒定提取工艺中的提取时间和液料比，考察不同提取超声波功率（30、60、120、240、360 W）对总黄酮含量的影响。从图1（C）可见，总黄酮含量在提取功率240 W 时达到峰值，总体表现为先升后降趋势，可能原因为过高超声波功率会破坏并分解黄酮成分。
3.2 响应面优化提取工艺
3.2.1 响应面实验设计及结果将上述“3.1”的单因素实验，作为提取工艺优化的基础，利用Box-Benhnken 试验设计法［5］对乌饭树叶总黄酮的提取工艺进行优化，将提取时间等单因素作为自变量，乌饭树叶总黄酮提取率作为应变量，考察了单因素不同水平的影响，通过Design-Expert 8.0.6 软件，得到响应面实验的方案以及实验结果，具体数据详见表1、表2。
表1 提取因素与水平设计表
表2 Box-Benhnken试验设计及结果
3.2.2 响应面回归拟合结果实验数据经过Design-Expert 8.0.6 软件回归拟合，乌饭树叶总黄酮各因素回归方程：Y（总黄酮百分量）=42.85+0.072A+0.11B+0.060C-0.50AB+0.16AC-0.11BC-1.33A2-0.61B2-0.79C2。方程式将3 个单因素（提取时间、液料比、提取超声功率）都进行编码处理，由表3 可知，单因素二次项多元回归拟合结果表明单因素交互项对总黄酮提取工艺有显著影响（P＜0.001）。
表3 回归分析结果
3.2.3 响应面图及等高线分析将不同交互项分别做出三维响应面图和对应二维等高线，响应面图和对应等高线均能直观反映单因素和响应值（Y）三者之间的交互作用关系。从图2 中可见，当某个单因素保持一定时，乌饭树叶总黄酮提取率会随着其他两个单因素的增加，表现出先升后降趋势，此结果表明单因素两两之间交互作用显著，且对乌饭树叶总黄酮的提取收率呈显著影响关系。
图2 两单因素交互作用对含量影响的响应面和等高线图：I.提取时间与液料比；
II.提取时间与超声波功率；
III.液料比与超声波功率
3.2.4 验证性实验经过对实验模型进行验证分析，乌饭树叶总黄酮提取最佳工艺参数为提取时间（120 min）、提取超声功率（240 W）、液料比（40∶1），最佳提取工艺的总黄酮理论收率为41.3 mg/g。为验证提取工艺效果，按照上述工艺参数进行3 次平行实验，3 次平行实验的总黄酮收率平均值为40.7 mg/g，与理论预测值对比的RSD＜5%。
4.1 乌饭树叶总黄酮的制备
按照上述响应面优化方法提取乌饭树叶总黄酮，并采用硝酸铝法测定总黄酮纯度（对照品为芦丁），最终测得总黄酮纯度为86.34%。
4.2 乌饭树叶总黄酮的体内抗肿瘤实验
分别选取25 只4T1（小鼠乳腺癌细胞）和25只A549（人肺癌细胞）的BALB/c 荷瘤小鼠作为实验对象，称重后两种小鼠均随机分为5 组。5 组分别为空白对照组（相同体积PBS：磷酸盐缓冲生理盐水）、MTX 组（甲氨蝶呤，腹腔注射，20 mg/kg，隔日1 次）、乌饭树叶总黄酮低、中、高剂量组（灌胃给药50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，1 次/d），连续给药12 d 后，处死小鼠，称重分离出肿瘤组织。抑瘤率公式：抑瘤率（%）=（C-T）/C×100%（C：对照组肿瘤质量，T：给药组肿瘤质量）。所有实验数据采用SPSS18.0 软件处理，采用t检验，检验水准α=0.05，当P＜0.05 时表示差异有统计学意义，见表4。
表4 乌饭树叶总黄酮对荷瘤小鼠肿瘤的抑制效果（）
表4 乌饭树叶总黄酮对荷瘤小鼠肿瘤的抑制效果（）
由表4 可知，小鼠在乌饭树叶总黄酮给药后体重正常，乌饭树叶总黄酮给药组小鼠与空白对照组的体重相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。乌饭树叶总黄酮高剂量组肿瘤质量比空白对照组小，高剂量组、MTX 组的抑瘤率与空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。
近年来，乌饭树叶中化学成分的药用价值［6-7］，受到药学工作者的广泛关注，尤其是乌饭树叶中含有的黄酮类化学成分，逐渐成为研究热点。因为研究表明［8］，乌饭树叶中的总黄酮成分，在治疗肿瘤上有较好的作用，如人体前列腺癌细胞株等，Barbara 等［9］的研究证实了这点。本研究通过Box-Behnken 实验设计法及对响应面资料分析，建立了乌饭树叶总黄酮提取工艺的数据模型，通过建立的回归拟合方程分析了单因素交互项对提取工艺的影响，采用响应面分析法绘制了响应面图和对应等高线，并描述了单因素和响应值（Y）三者之间的交互作用关系，最终得出提取工艺的最佳参数。通过3 次平行验证实验，总黄酮收率与理论预测值相符性良好。
本研究为进一步观察乌饭树叶总黄酮的抗肿瘤活性，选择4T1 和A549 的BALB/c 荷瘤小鼠作为实验对象，实验结果显示，乌饭树叶总黄酮高剂量组肿瘤质量明显低于空白对照组，高剂量组抑瘤率与空白对照组相比，差异有统计学意义。本实验发现乌饭树叶总黄酮具有较强的抗肿瘤活性，进一步完善了乌饭树叶总黄酮的抗瘤谱［10］，为提高乌饭树植物资源的综合利用，从天然动植物中寻找更加高效、低毒的抗肿瘤药物奠定了一定基础。
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