吕敏玲，钟 欣，李 静，3，黄 琦，马梦情，孙嘉玲，周小舟
（1.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033；
2.深圳市中医院肝病科，广东 深圳 518033；
3.澳门科技大学，中国澳门 999078）
当前肝癌仍是全球性的健康挑战，其发病率正在逐年上涨。其中，原发性肝癌是我国高发的，对人们的健康造成极大危害的恶性肿瘤之一。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）约占原发性肝癌总病例数的90%［1］，是第六大常见的肿瘤和第三大癌症死亡原因［2］。尽管已有许多针对肝癌的治疗手段，但由于HCC 具有异质性，其疗效及预后仍不尽人意。肝癌属于中医学中的“积聚”、“癥瘕”、“鼓胀”等病证。基于中医理论的遣方用药在治疗肝癌方面效果显著，在控制肝癌的进展、延缓其转移及复发、提高患者的生存率、改善其生活质量等具有独特优势［3，4］。因此，基于中医药学理论从传统中药寻找并开发针对HCC 的有效抗肿瘤药物成分不失为切实可行的研究策略。
香加皮来源于萝蘑科植物杠柳，为常用传统中药，本品性温，味辛苦，归肝、肾、心经，杠柳甙元（Periplogenin，PPG）为其主要化学成分之一［5］。据文献报道，PPG 具有显著的抗肿瘤效果：其通过靶向STAT3、BIP-eIF2α- CHOP 和IRE1α-ASK1-JNK等信号通路抑制各种肿瘤的生长及促进其凋亡［6-8］，但目前关于PPG 针对HCC 的抗肿瘤作用研究较少，其如何影响肝癌细胞的恶性生物学行为，及其作用机制尚未完全明确。因此，本文以探讨PPG 对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移的调控及作用机制为研究目标，为肝癌的治疗发掘新的思路。
1.1 材料
Hep3B 人肝癌细胞系（美国模式培养物集存库）；
杠柳甙元（Periplogenin，PPG）（批号：S9168，上海蓝木化工有限公司）；
DMEM 高糖培养基、青-链霉素双抗、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶、1×PBS 缓冲液（美国Gibco 公司）；
CCK-8 细胞活性检测试剂、结晶紫染色液（批号：c0043、C0121，上海碧云天生物技术有限公司）；
细胞核染料PI 染色液（即用型）（批号：KGA1018，江苏凯基生物技术股份有限公司）；
Cleaved Caspase-3/Caspase-3（1∶800 稀 释）抗体（批号：19677-1-AP，美国Proteintech 公司）；
Bcl-2（1∶800 稀释）抗体、MMP-9（1∶1 000 稀释）抗体、HRP 标记的IgG 二抗（1∶2 000 稀释）抗体（批号：ab182858、ab38898、ab6721，英 国Abcam 公 司）；
GAPDH（1∶1 000 稀释）抗体（批号：2118s，美国CST 公司）；
DMSO（北京Solarbio 公司）；
DAPI 染色液（即用型）、SDS-PAGE 凝胶试剂盒、蛋白上样缓冲液（5×）（批号：BL105A、BL522A、BL502B，北京兰杰柯科技有限公司）；
RIPA 裂解液、预染蛋白Marker、BCA 蛋白浓度检测试剂盒、ECL 化学发光试剂（批号：89900、26616、23227、34578，赛默飞世尔科技有限公司）；
蛋白酶抑制剂（批号：4693132001，瑞士罗氏公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 高糖DMEM 完全培养基含10%胎牛血清及1%青-链霉素双抗，用于培养Hep3B 细胞，并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育，待细胞贴壁，生长密度达80%～90%时，用1×PBS 缓冲液清洗2 次，胰蛋白酶进行细胞消化，1∶2 比例传代，使用对数生长期的细胞进行后续实验。
1.2.2 实验分组 分为空白组、PPG 干预组。空白组的Hep3B 细胞未行处理，PPG 组的Hep3B 细胞根据药物作用效果在半抑制浓度前后分别选取2.5、5、12.5 μmol/mL 浓度的PPG 干预48 h。
1.2.3 CCK-8 法检测细胞增殖能力 将Hep3B 细胞接种于96 孔板，密度为2×104个/孔，过夜培养，待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入浓度为（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培养基干预Hep3B 细胞48 h，并预空白调零孔，每组至少3 个复孔，48 h 后弃去培养基，各组细胞中加入含10 μL CCK-8 试剂的无血清DMEM 培养液，继续避光孵育1 h，使用酶标仪450 nm 波长处测定各组光密度值（OD 值），计算PPG 对Hep3B 细胞活力的抑制作用，计算公式：细胞增殖抑制率（%）=［1-（OD 值实验孔-OD 值调零孔）/（OD 值对照孔-OD 值调零孔）］×100%。
1.2.4 平板克隆形成实验观察细胞增殖状况 各组Hep3B 细胞经PPG 处理后以1 000 个/孔均匀铺盖到6 孔板中，定期更换培养液，待2 周后每个克隆＞50 个细胞即为阳性克隆，弃去原培养液，PBS 缓冲液洗涤1 次，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，双蒸水洗净染色液，晾干，拍照，统计每孔克隆形成数。
1.2.5 倒置显微镜观察细胞形态变化 将Hep3B细胞接种于6 孔板，密度为5×105个/孔，待细胞贴壁后弃去培养液，分别加入浓度为（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培养基干预Hep3B 细胞，干预48 h后使用倒置显微镜进行拍照。
1.2.6 DAPI/PI 染色实验观察细胞凋亡状态 处于对数生长期的Hep3B 细胞以0.8×105个/孔的细胞密度接种于24 孔板，过夜培养，待细胞贴壁后，分别加入浓度为（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培养基干预Hep3B 细胞48 h 后弃去原培养液，PBS 缓慢轻柔冲洗3 次，加入PI 染色液，每孔500 μL，室温避光作用5～10 min，弃去PI 染色液，PBS 缓慢轻柔洗涤3 次，每次3 min，使用预冷甲醇溶液固定通透10 min，弃去甲醇，PBS 缓慢轻柔洗涤3 次，每次3 min，加入DAPI 染色液，每孔500 μL，室温避光作用5～10 min，弃去DAPI 染色液，PBS 缓慢轻柔洗涤3 次，每次3 min，抗荧光淬灭封片液封片，360 nm 激发波长观察细胞。
1.2.7 划痕实验观察细胞迁移能力 处于对数生长期的Hep3B 细胞以5×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，过夜培养，待细胞贴壁后，使用无菌移液枪头沿垂直线快速刮板底部的细胞层，刮板后PBS 缓慢轻柔洗涤2 次，分别加入浓度为（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培养基干预Hep3B 细胞，在干预后0 h 及48 h 在显微镜下观察细胞迁移程度并拍照，并根据划痕愈合情况计算细胞迁移率。迁移率=［（0 h 迁移距离-48 h迁移距离）／0 h迁移距离］×100%。
1.2.8 Western blot 检测凋亡相关蛋白（Cleaved Caspase-3/Caspase3、Bcl-2）、迁移相关蛋白（MMP-9）Hep3B 细胞按照上述1.2.3 方法分组处理48 h后，弃原培养液，PBS 洗2 次后加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰面上裂解，细胞刮刮取细胞，离心后取上清，BCA 法测蛋白浓度，制备15% 的SDSPAGE 凝胶，各组取等量蛋白样品并加入上样缓冲液上样，进行凝胶电泳后，电转至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别使用相应比例的一抗4 ℃孵育过夜，HRP 标记的IgG 二抗室温孵育1 h，用ECL 发光液显影，以GAPDH 作为内参，Image Lab软件分析各组目的蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理
上述实验均重复3 次，使用SPSS 25.0 进行数据分析，当实验数据符合正态分布时，使用单因素方差分析法（one-way ANOVA）进行统计处理，以（±s）表示；
非正态分布时，使用非参数检验法进行统计处理，以中位数（P25，P75）表示；
当P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
2.1 PPG 对Hep3B 细胞增殖抑制率
分别用不同浓度的PPG 干预Hep3B 细胞后，CCK-8 结果表明（表1），PPG 能够有效抑制Hep3B细胞的增殖，并呈浓度及时间依赖性，随着PPG 浓度增加及时间的推移，对Hep3B 细胞的抑制率依次升高（P＜0.05）。
表1 各组Hep3B 细胞增殖抑制率的比较（±s）Tab 1 Comparison of proliferation inhibition rates of Hep3B in each group（±s）
表1 各组Hep3B 细胞增殖抑制率的比较（±s）Tab 1 Comparison of proliferation inhibition rates of Hep3B in each group（±s）
注：与空白组比较，*P＜0.05。
组别剂量（μmol/mL）细胞增殖抑制率（%）空白组2.5 μM 组5 μM 组7.5 μM 组10 μM 组12.5 μM 组F48 h 0 20.74±6.94 37.70±2.76*51.09±3.77*73.95±1.83*76.81±2.62*203.828 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 24 h 0 18.20±4.70*24.30±3.74*27.31±3.32*24.00±4.20*26.50±4.91*21.717
2.2 PPG 对Hep3B 克隆形成能力的影响
不同浓度的PPG 干预Hep3B 细胞后，Hep3B 的克隆群落随着干预浓度的增加而减少（均P＜0.05）见图1 及表2。
图1 各组Hep3B 细胞的克隆形成能力比较Fig 1 Comparison of clone forming abilities of Hep3B in each group
表2 各组Hep3B 细胞克隆形成数比较（±s）Tab 2 Comparison of clone formation numbers of Hep3B in each group（±s）
表2 各组Hep3B 细胞克隆形成数比较（±s）Tab 2 Comparison of clone formation numbers of Hep3B in each group（±s）
注：与空白组比较，*P＜ 0.05。
组别克隆形成数剂量（μmol/mL）空白组2.5 μM 组5 μM 组12.5 μM 组F39.33±8.50 22.33±10.12*12.33±3.51*7.33±1.53*12.634 0 2.5 5.0 12.5
2.3 PPG 对Hep3B 细胞的形态及凋亡的影响
不同浓度的PPG 干预Hep3B 细胞后，可观察到细胞体积缩小，细胞核固缩或破裂等细胞凋亡现象，并随着干预浓度增加，活细胞密度减少，凋亡细胞逐渐增多，见图2、3。
图2 各组Hep3B 细胞的形态及密度比较（×200 倍）Fig 2 Comparison of the morphology and density of Hep3B in each group（×200）
图3 各组Hep3B 细胞的PI 染色比较（×100 倍）Fig 3 Comparison of PI staining of Hep3B in each group（×100）
2.4 PPG 对Hep3B 细胞迁移能力的影响
如图4、表3 所示，与空白对照组相比较，Hep3B细胞的划痕愈合率随着干预浓度的增加而降低（P＜0.05），说明PPG 能够抑制Hep3B 细胞的迁移。
表3 各组Hep3B 细胞迁移率比较［中位数（P25，P75）］Tab 3 Comparison of cell mobility of Hep3B in each group［Median（P25，P75）］
图4 各组Hep3B 细胞的迁移能力比较（×100 倍）Fig 4 Comparison of migration abilities of Hep3B in each group（×100）
2.5 PPG 对Hep3B 细胞中凋亡相关蛋白（Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3）表达水平的影响
与空白组相比，PPG 处理Hep3B 细胞后Bcl-2蛋白水平降低，Cleaved Caspase-3/Caspase-3 水平升高，并呈浓度依赖性（P＜0.05）。见图5 及表4。
图5 各组Hep3B 细胞中Caspase3、C-Caspase3、Bcl-2 蛋白表达的比较Fig 5 Comparison of Caspase3，C-Caspase3 and Bcl-2 protein expressions in Hep3B in each group
表4 各组Hep3B 细胞Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平变化比较（±s）Tab 4 Comparison of the expression levels of Cleaved Caspase-3/Caspase-3 and Bcl-2 proteins in Hep3B in each group（±s）
表4 各组Hep3B 细胞Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平变化比较（±s）Tab 4 Comparison of the expression levels of Cleaved Caspase-3/Caspase-3 and Bcl-2 proteins in Hep3B in each group（±s）
注：与空白组比较，*P＜ 0.05。
组别Bcl-2剂量（μmol/mL）Cleaved Caspase-3/Caspase-3空白组2.5 μM 组5 μM 组12.5 μM 组F0 2.5 5.0 12.5 0.44±0.24 0.64±0.39 0.95±0.45 1.91±0.70*0.85±0.03 0.45±0.15*0.39±0.15*0.41±0.10*10.065 5.607
2.6 PPG 对Hep3B 细胞中MMP9 蛋白表达水平的影响
与空白组相比，PPG 处理Hep3B 细胞后MMP-9 蛋白水平降低，并呈浓度依赖性（P＜0.05）。见图6 及表5。
表5 各组Hep3B 细胞MMP-9 蛋白表达水平变化比较（±s）Tab 5 Comparison of MMP-9 protein expression levels in Hep3B in each group（±s）
表5 各组Hep3B 细胞MMP-9 蛋白表达水平变化比较（±s）Tab 5 Comparison of MMP-9 protein expression levels in Hep3B in each group（±s）
注：与空白组比较，*P＜ 0.05。
MMP-9 0.57±0.05 0.41±0.17 0.33±0.08 0.20±0.05*7.120组别空白组2.5 μM 组5 μM 组12.5 μM 组F剂量（μmol/mL）0 2.5 5.0 12.5
图6 各组Hep3B 细胞中MMP-9 蛋白表达的比较Fig 6 Comparison of MMP-9 protein expression in Hep3B in each group
肝细胞癌（HCC）为最常见的实体恶性肿瘤之一，其肿瘤发生是一个涉及多种危险因素的复杂过程。近年来，HCC 的非药物疗法和药物疗法取得较快的发展。然而，尽管HCC 有多种治疗方法，患者的总体生存率仍远未令人满意，对更有效的治疗方法的需求仍未得到满足。因此，开发一种针对HCC的有效药物成分，以阻遏HCC 发生发展意义重大。中医认为，肝癌的发生主要由于肝、脾、肾诸脏腑功能失调，气血升降失调，水液气化失司，久而生风、湿、痰、热、瘀等邪气，迁延日久，邪气久客体内，气、血、水等相互结聚体内，聚于腹腔，常合并腹水［9］。香加皮能够利水消肿、温通祛风渗湿。越来越多的证据表明，香加皮的提取物及其活性成分能够发挥显著的抗肿瘤活性［10］。杠柳甙元（PPG）是香加皮中的主要活性化学成分，但PPG 对肝癌的作用机制尚不明确。本研究发现，PPG 能够有效抑制肝癌Hep3B 细胞的增殖和迁移，促进Hep3B 的凋亡，并且具有剂量依赖性。进一步机制研究发现，经PPG处理的Hep3B 细胞Caspase-3 蛋白表达降低，Cleaved Caspase-3 蛋白表达上调，同时抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达水平降低，诱导Hep3B 细胞的凋亡。在肿瘤细胞的杀伤中细胞凋亡是至关重要的一环。Caspase 家族能够促进细胞的程序性死亡，是一组高度保守的细胞内蛋白水解酶，在细胞凋亡中扮演关键的生物角色［11-13］。在细胞凋亡的过程中，Caspase-3 被激活并开始分解蛋白质，导致细胞死亡，因此成为重要的抗癌治疗的主要目标［14］。Bcl-2 是一种抗凋亡蛋白，其介导的对内在凋亡途径的抵抗是恶性肿瘤的一个标志，针对抗凋亡Bcl-2 蛋白是癌症治疗中一个具有吸引力的策略［15，16］。本研究结果表明，PPG 可能通过调控Caspase 通路蛋白及Bcl-2蛋白抑制肝癌细胞增殖，在肝癌细胞凋亡诱导方面发挥着抗肿瘤的作用。
大多数恶性肿瘤具有高度的迁移和侵袭的能力，并与肿瘤转移密切相关。本研究中，PPG 还具有降低Hep3B 细胞MMP-9 蛋白表达水平的作用。基质金属蛋白酶9（MMP-9）在细胞外基质（Extra cellular matrix，ECM）的重塑、转移、血管生成、细胞凋亡和癌症进展中发挥重要作用，其在各种类型癌症中的表达水平常升高，因此，MMP-9 及其抑制剂可能是抗癌药物的重要目标［17，18］。本研究提示PPG可能通过MMP-9 通路调控肝癌细胞Hep3B 的恶性生物学行为。
综上所述，PPG 可有效抑制肝癌Hep3B 细胞的增殖、迁移，促进其凋亡，其作用机制可能与激活Caspase 信号通路、抑制MMP-9 活性相关，为一种治疗肝癌的潜在药物。
作者贡献度说明：
吕敏玲：进行研究构思、实验操作、数据分析、文稿起草；
钟欣、李静：参与实验方案设计、文稿修改、实验技术指导；
黄琦：参与细胞培养；
马梦情：参与细胞增殖抑制检测、Western blot 实验；
孙嘉玲：提供研究经费支出、技术支持；
周小舟：负责研究构思、研究经费支出、文稿修正。
所有作者声明不存在利益冲突关系。
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