尹秋玉， 朱雅婷， 许文婷， 欧江华
(1新疆医科大学， 乌鲁木齐 830017；
2新疆医科大学附属肿瘤医院药学部， 3新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科， 乌鲁木齐 830000)
在一项美国女性乳腺癌筛查中，乳腺癌以最常见的肿瘤，成为癌症第二大死亡原因[1]。三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及人表皮生长因子受体(HER2)表达全为阴性的乳腺癌，占乳腺癌类型的20%左右[2]。化疗成为TNBC唯一的全身治疗选择[3]。尽管以铂类为基础的化疗方案还未被批准为乳腺癌的标准治疗方案，但其临床治疗效果较为理想[4-5]，然而长期用药发现，随着应用时间的延长，其显示出较为明显的耐药性和细胞毒性，是导致化疗失败的主要原因[6]。
有研究指出，FOXO蛋白有助于调节肿瘤细胞的敏感性和耐药性[7-8]，通过多种途径影响肿瘤耐药。为了提供更多的基础理论支持，本实验构建顺铂耐药的TNBC细胞，了解叉头框基因O4(FOXO4)在顺铂耐药TNBC细胞中的作用，再通过构建FOXO4基因过表达细胞株，探讨FOXO4对TNBC耐药细胞顺铂敏感性的影响，为进一步研究FOXO4在乳腺癌顺铂耐药中的作用机制提供新的细胞模型和更多理论支持。
1.1 细胞与药品三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)购自武汉普诺赛生物细胞库，顺铂(货号MB1055)购自大连美仑生物技术有限公司，嘌呤霉素(货号A610593)购自上海生物工程股份有限公司。
1.2 主要试剂和仪器DMEM(高糖)培养基、L-15培养基、青霉素-链霉素双抗(10000U)、胰酶(0.25% Trypsin-EDTA)购自美国Gibco公司；
胎牛血清购自澳洲Excell Bio公司；
PBS磷酸盐缓冲液粉剂购自北京中杉金桥生物公司；
DMSO(二甲基亚砜)购自德国Sigma公司；
CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；
病毒助感染试剂HitransG A、病毒助感染试剂HitransG P、LV-FOXO4-OERNA、阴性对照病毒、GV492载体，BamHI / AgeI 酶切均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 耐药细胞株的建立 取人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和BT549培养在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的混合DMEM高糖培养基中。在培养基加入2 μg/mL的DDP，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养48 h，弃含药培养基，加不含药物培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养，待细胞生长至对数生长期，重复剂量诱导，剂量为2 μg/mL到64 μg/mL递增方式干预。期间需在不同时间段(每周)确定耐药指数(RI)，当耐药指数达到4时，认为耐药细胞株建立成功。细胞诱导成功后，将细胞在无药物的培养基中培养3～4周，再进行各项实验。
1.3.2 目的基因片段的制备与慢病毒载体的构建 利用PCR技术扩增FOXO4基因(mRNA序列号：NM_005938)片段。FOXO4引物序列：5′-GCCAAGGTTATTGTCCGCTAAA，3′-GTCCCTCCCACCCTCAATGAAG。根据FOXO4基因全序列设计PCR引物，并在其上下游分别用限制性内切酶BamHI和AgeI酶切相应位点获得线性化载体，然后利用DNA琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定并回收。将目的基因扩增片段与酶切产物进行连接反应，得到FOXO4基因的重组慢病毒连接产物LV-FOXO4。将连接产物进行转化，挑取单菌落进行质粒DNA提取与双酶切凝胶电泳鉴定。对鉴定正确的质粒进行测序验证，序列对比正确即表明重组慢病毒表达载体构建成功。
1.3.3 慢病毒包装以及滴度检测 采用载体质粒GV492、病毒包装辅助质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞，转染48～72 h后收集细胞上清液。在4℃条件下，以4 000 r/min离心10 min。用0.45 μm滤器过滤上清液收集病毒浓缩液，根据荧光显微镜下荧光表达情况应用倍比稀释法检测病毒滴度。
1.3.4 预实验确定最佳感染条件 将培养好的耐药株用完全培养基制备2 mL密度为5×104个/mL的细胞悬液，在96孔板中每孔加入100 μL悬液，37℃培养24 h，至细胞汇合度达30%左右。从冰箱取出阴性对照病毒，冰上缓慢融化，用无血清培养基依次将病毒稀释至滴度为1×108TU/mL，1×107TU/mL，1×106TU/mL，各50 μL。吸掉各孔中上清液，加入病毒及相应助感液，混匀，继续培养。感染12 h后换回正常培养基，感染约48 h，当荧光表达丰度较高时，用显微镜观察荧光表达情况。将感染效率80%左右且生长状态良好的组所对应的感染条件和转染复数值(MOI)作为后续感染实验的依据。
1.3.5 确定嘌呤霉素最适剂量 取生长状态良好、汇合率达90%的耐药株细胞，用完全培养基制备成5×104个/mL单细胞悬液，接种至96孔板中(每孔100 μL，5个复孔)。接种24 h细胞贴壁后，将FOXO4过表达慢病毒在助转试剂A下转染后，使用不同浓度嘌呤霉素(0、0.5、1.5、2.5、5 μg/mL)干预72 h，后于显微镜下观察细胞生长状态，以绝大部分(约90%)细胞死亡所对应的嘌呤霉素浓度作为最佳筛选浓度。
1.3.6 病毒转染和稳转株的筛选 用完全培养基制备2 mL密度为5×104个/mL的细胞悬液，在96孔板中每孔加入100 μL悬液，37℃培养24 h。首先将GV492病毒冰上融化，根据预实验筛选的最佳MOI值和助感液类型进行相应稀释后备用。弃原培养液加入已稀释好的病毒和助感液，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。将实验细胞分为4组：MDA-MB-231组(Control组)、MDA-MB-231/DDP组(耐药组)、NC组(GV492-空载组)以及FOXO4-OERNA组(FOXO4-过表达组)。转染72 h后，NC组和FOXO4-OERNA组更换用含最适嘌呤霉素浓度的培养基培养，每隔3天更换新鲜的含有嘌呤霉素的培养基，待细胞稳定传代后收集细胞进行验证。
1.3.7 qRT-PCR检测FOXO4 mRNA 的表达量 收集转染前后生长状态良好的细胞，弃原培养基，加入1 mL Trizol消化细胞，后续实验按照qRT-PCR实验报告操作，用 2- ΔΔCt法计算FOXO4 mRNA的表达水平。
1.3.8 Western blotting检测目的基因表达 取4组细胞(Control组、耐药组、 NC组以及FOXO4-OERNA组)分别用磷酸缓冲盐溶液洗涤，然后于浓缩胶和分离胶中分别电泳，在4℃、300 mA恒流条件下电转150 min，将蛋白转移到 PVDF膜上。5%脱脂奶封闭，先后加入一抗和HRP标记的二抗，在室温下分别孵育2 h和1.5 h，洗膜、曝光后检测条带灰度值，分析各组细胞目的基因蛋白的相对表达量。
1.3.9 CCK-8法确定耐药指数 取对数期生长状态良好的Control组、耐药组和FOXO4-OERNA组细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，以每孔5×104个/mL密度接种于96孔板中，置于37℃、5%二氧化碳恒温培养箱中培养，加入配置好的10% CCK-8溶液避光培养，酶标仪测定450 nm处的吸光度值，通过计算顺铂半致死浓度(IC50)值确定细胞耐药指数RI和逆转指数，RI=各组耐药细胞系的IC50/敏感细胞系的IC50，逆转指数=IC50(耐药细胞) / IC50(耐药细胞+FOXO4-OERNA)。
2.1 顺铂耐药细胞株的构建通过小剂量浓度梯度法诱导MDA-MB-231细胞，构建MDA-MB-231/DDP顺铂耐药细胞株。与亲本株MDA-MB-231细胞相比，MDA-MB-231/DDP的抑制率更低，差异有统计学意义(P<0.05) (图1)。MDA-MB-231/DDP和MDA-MB-231的IC50值分别为28.344 μg/mL和5.418 μg/mL，RI=5.231。RI>4，表明耐药细胞株构建成功。
DDP concentration (μg/mL)
2.2 FOXO4在TNBC顺铂耐药细胞株中的表达qRT-PCR检测结果显示，目的基因FOXO4在耐药细胞株MDA-MB-231/DDP中的表达较亲本株MDA-MB-231显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)(图2)，提示FOXO4可能与TNBC顺铂耐药具有显著相关性。
注：与MDA-MB-231组相比， **P<0.01。
2.3 FOXO4过表达稳转细胞株的构建
2.3.1 重组慢病毒质粒鉴定 重组慢病毒质粒LV-FOXO4经BamHI和AgeI双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳(图3)，电泳结果可见一条1 500 bp左右的条带，与目的基因理论值1 559 bp相符。重组质粒测序结果见图4，质粒中插入的目的基因片段与FOXO4基因序列一致，表明FOXO4基因成功插入GV492载体中。
注：1，阴性对照(ddH2O)；
2，阴性对照(空载自连对照组)；
3，阳性对照(GAPDH)；
4，转染组 5-12：
1-8号转化子。
图4 重组慢病毒质粒FOXO4插入片段的部分测序图谱
2.3.2 病毒滴度检测与荧光表达情况 病毒滴度结果显示，FOXO4慢病毒的滴度为3.5×108TU/mL，NC组的滴度为1.0×108TU/mL。转染慢病毒后的LV-FOXO4细胞用嘌呤霉素培养基筛选出FOXO4稳定株，当细胞几乎无死亡现象时，表明细胞具有嘌呤抗性。对照组为未转染病毒的组，暗场观察不到荧光；
加入不同体积的慢病毒后，可明显观察到绿色荧光，表明目的基因慢病毒转染成功(图5)。
图5 荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光表达情况
2.3.3 转染最佳MOI值、助感染液的确定 在不同浓度病毒感染MDA-MB-231/DDP细胞48 h后，倒置显微镜下观察各组细胞荧光表达情况，将感染效率80%左右且生长状态良好的组所对应的感染条件和MOI值作为后续感染实验的依据。根据荧光表达结果显示(图6)，确定MOI=100、HitransG A助感液为病毒最佳感染条件。
2.3.4 嘌呤霉素最适筛选浓度的确定 经不同浓度嘌呤霉素(0、0.5、1.5、2.5、5 μg/mL)干预72 h后，于显微镜下观察细胞生长情况(表1)。当嘌呤霉素浓度达到2.5 μg/mL时，细胞死亡率达到90%以上，且随着嘌呤霉素浓度的继续增加，细胞死亡率未见明显升高，差异无统计学意义(P>0.05)。因此，将2.5 μg/mL确定为嘌呤霉素最佳筛选浓度。
表1 不同浓度嘌呤霉素对MDA-MB-231/DDP细胞增殖的影响
图6 MDA-MB-231/DDP细胞感染荧光图片
2.4 qRT-PCR检测FOXO4表达情况qRT-PCR检测结果显示：NC组的基因表达量(1.034±0.302)较Control组(1.051±0.257)无明显差异。FOXO4-OERNA组的基因表达量(3.459±0.983)较Control组和NC组，表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明FOXO4过表达耐药细胞株构建成功，基因表达柱状图见图7。
注：与Control和NC组比较，*P<0.05。
2.5 Western blotting检测目的基因表达情况Western blotting结果显示，耐药组FOXO4蛋白表达明显低于Control组和FOXO4-OERNA组，且FOXO4-OERNA组蛋白表达明显高于NC组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图8)。
注：与Control组和FOXO4-OERNA组相比， *P<0.05；
与NC组相比，#P<0.05。
2.6 过表达FOXO4可逆转MDA-MB-231/DDP细胞对顺铂的耐药性CCK-8法检测显示， FOXO4-OERNA组对顺铂的IC50值为16.598 μg/mL，耐药指数RI=3.063，与转染前MDA-MB-231/DDP组RI值(5.231)相比，逆转指数达到1.708，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。
表2 转染前后各组细胞耐药指数和逆转指数
以铂为基础的化疗在三阴性乳腺癌治疗中表现出较好的效果[2]，但目前乳腺癌治疗有效率仍然不高，这与治疗过程中产生的耐药性有关，是治疗过程中的一个关键问题[9]。因此，尽快找到影响铂类耐药的有效分子靶点，是目前逆转乳腺癌顺铂耐药的关键。
叉头框基因FOXO4作为公认的肿瘤抑制因子，影响着多种癌症的发生发展[10]。Yu等[11]指出，迷迭香酸通过下调miR-6785-5p和miR-642a-3p以增加FOXO4的表达，从而增强胃癌SGC7901耐药细胞对5-FU的化疗敏感性。在结肠癌中，FOXO4的激活有利于减轻细胞对化疗药物的耐药性[12]。在鼻咽癌中, 上调miRNA-421通过靶向FOXO4的3′端非编码区抑制其转录活性，从而影响细胞增殖[13]。双硫仑由于其抗肿瘤特性，与铜联合疗法目前正在进行转移性乳腺癌患者的II期临床试验，Kaowinn等[14]指出，双硫仑通过诱导FOXO4转录因子的表达，使细胞周期停滞在G1期，从而增强顺铂等化疗药物的抗增殖作用。本实验通过qRT-PCR和Western blotting检测FOXO4在顺铂耐药株和病毒转染株中的表达差异，初步验证了FOXO4基因在顺铂耐药株MDA-MB-231/DDP中的表达量是降低的，与我们的前期研究结果一致：在顺铂耐药患者病理标本中FOXO4呈低表达状态。
逆转录病毒作为近年来使用较为广泛的载体，已被普遍应用于各种癌症的研究[15]。其包括三种类型的载体，分别是慢病毒、腺病毒以及腺相关病毒(AAV)载体。在病毒载体中，慢病毒载体作为肿瘤基因治疗中最有前途的基因传递系统之一，具有进入细胞并将遗传物质稳定运送到目的细胞的能力[16-17]，目前广泛应用于过表达实验的研究。慢病毒DNA能够在病毒整合酶的作用下稳定地插入到宿主基因组中，从而将非增殖或缓慢增殖的细胞进行有效转导[18-19]。本研究通过将LV-FOXO4-OERNA慢病毒载体质粒成功转染入耐药细胞株MDA-MB-231/DDP中增强目的基因FOXO4的表达，在一定程度上恢复了TNBC对顺铂的敏感性。Shi等[20]综述了FOXO在卵巢癌铂类耐药的环境中表达量是降低的，这可能与PI3K/Akt/FOXO信号通路有关。本研究通过基因过表达实验，发现FOXO4具有逆转乳腺癌顺铂耐药性的作用，推测FOXO4可能是乳腺癌顺铂耐药的一个重要分子靶点，然而本实验仅局限于细胞方面的研究，缺乏相应的动物实验，其影响耐药的具体机制还需要进一步深入研究。
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