秦玉洁， 周文秀， 周兴念， 程明亮， 李 宏
1 贵州医科大学， 贵阳 550025；
2 贵州医科大学附属医院 感染科， 贵阳 550025
原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种慢性自身免疫性的胆汁淤积性肝病，其特点是慢性胆汁淤积、小叶间胆管破坏，严重者可进展为肝硬化、肝功能衰竭[1]。该病以女性为主，男女比例约为1∶8，亚太地区PBC总体患病率为9.8/100 000，中国达8.99/100 000[2]。PBC的病因是多因素的，大约三分之一的患者对熊去氧胆酸(UDCA)治疗应答不佳。遗传因素在自身免疫性疾病中起重要作用，但是PBC遗传学的研究进展仍较缓慢，全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)显著提高了评估复杂疾病遗传关系的能力[3]。本报告通过对母女二人进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)测序、分析，揭示了PBC的遗传易感性，患者母亲存在AIH-PBC重叠综合症，同时存在自身免疫性胰腺炎。本研究筛选了母女二人PBC的一致候选基因，报告如下。
患者女性，68岁，主诉“厌油、纳差1周”于2021年3月21日入院。入院查体全身皮肤巩膜轻度黄染，肝区叩击痛阳性。肝功能检查示：ALT 1073.50 U/L，AST 1172.10 U/L，TBil 55.70 μmol/L，DBil 39.60 μmol/L，IBil 17.65 μmol/L，Alb 37.00 g/L，A/G 0.940，GGT 210.42 U/L，ALP 165.00 U/L，TBA 86.00 μmol/L。自身免疫性肝病相关自身抗体检查示：抗核抗体 (ANA) 阳性，抗线粒体抗体(AMA) 阳性，AMA-M2强阳性。免疫球蛋白示：IgG 27.4 g/L，IgM 0.95 g/L。甲、乙、丙、丁、戊型肝炎及铜蓝蛋白检查未见异常。上腹部MRI增强检查未见肝硬化及脾肿大，骨密度检查发现重度骨质疏松。肝穿刺病理活检提示中度界面炎，小叶间胆管上皮损伤，在肝门淋巴结中观察到大量淋巴细胞和浆细胞，HE染色可见散在的肝坏死和大量炎性细胞浸润，Masson染色显示肝门纤维化和纤维间隔形成，小叶间胆管损伤。IgG4染色阴性，IgG染色阳性(图1)。符合AIH-PBC重叠综合征，G2～3，S2。国际AIH组织评分(IAIHG)20分。给予UDCA 15 mg·kg-1·d-1，甲泼尼龙60 mg/d口服，骨质疏松症的对症治疗使用咀嚼维生素D钙片。患者肝功能明显好转，血清IgG4、IgG、IgA、IgM下降，患者出院后，因震颤和血压升高停用甲泼尼龙。随后肝功能恶化，调整用药为UDCA 15 mg·kg-1·d-1、甲泼尼龙8 mg、硫唑嘌呤0.5 mg，肝功能再次改善，肝功能和身体状态恢复到满意水平，该患者仍在随访中。
注：a，HE染色，×100；
b，Masson染色，×100；
c，IgG染色，×100；
d，IgG4染色，×100；
e，CK7染色，×100；
f，CK19染色，×100。
患者女儿，47岁，主诉“体检发现肝功能异常7年”。患者根据其母亲主诊医生建议进行肝穿刺病理检查。肝功能检查ALT 73.80 U/L，AST 59.00 U/L，GGT 341.00 U/L，ALP 219.00 U/L。ANA阳性， AMA强阳性，AMA-M2强阳性。免疫球蛋白：IgG 12.7 g/L，IgA 3.52 g/L，IgM 2.82 g/L。甲、乙、丙、丁、戊型肝炎及铜蓝蛋白未见异常。上腹部MRI增强扫描未见肝硬化及脾肿大，骨密度测定正常，IAIHG评分10分。肝穿刺病理活检提示肝细胞弥漫性水样变性，部分肝细胞内见色素颗粒沉积，肝窦内见少量单个核炎细胞为主的混合炎细胞，汇管区炎症表现，纤维组织增生，大量单个核细胞为主的混合炎细胞浸润，小叶间胆管损伤，空泡变，局灶胆管基底膜破坏。IgG4染色阴性，IgG 染色炎性细胞阳性(图2)。结合组织学特点及病史，患者ALT未达到5倍以上上限标准，暂不考虑诊断AIH，符合PBC Ⅰ期诊断。
候选遗传变异的筛选以“PASS”实施严格的遗传变异质量控制。为了识别感兴趣的PBC 候选基因中潜在的功能变异，去除了同义突变，并包括了非同义突变、剪接突变和移码突变。考虑到临床意义，笔者专注于包括 SIFT、PolyPhen2、突变评估器、con-del和FATHMM在内的工具来预测有害突变。为了探究与PBC相关的基因变异，保留了两例患者共有但正常家庭成员中(患者父亲)没有的突变。在NCBI、GeneCards、OMIM等数据库中检索候选基因的功能及其与免疫反应和免疫耐受的相关性。表1列出了两例患者(母亲和女儿)遗传变异的功能注释，发现两例患者的基因变异以错义突变居多，产生碱基突变和氨基酸突变，止损突变在所有基因突变类型中所占比例最小。经过质量控制和同义突变、高频突变、无临床意义突变的剔除，分别获得女儿298个基因突变和母亲293个基因突变。错义突变仍然是基因突变的主要类型(表2)。本研究调查了母亲和女儿之间同类的常见基因变异。共获得136个基因变异，其中错义突变130个，停止增益突变5个，剪接突变1个。通过母女常见遗传变异的基因富集分析，如果所有分析工具都预测为有害突变，则共有9个共同SNP位点，分别位于GPSM2、CACNA1S、CRYBA2、SLC7A14、CA13、NOTCH1、PNPLA7、IFT140和BEST2基因中(表3)。
表1 患者基因变异功能注释
表2 患者候选基因变异功能注释
表3 患者共有变异基因的 SNP 位点及相应氨基酸变化
PBC是自身免疫介导的慢性胆汁淤积性肝病，女性患者多见，其病因和发病机制尚未完全明确，其致病因素包括遗传易感性和环境因素[4]。研究[5-7]发现PBC先证者一级亲属的患病率高于健康对照组，PBC先证者一级亲属PBC患病风险较健康对照组增加约10倍，血清AMA阳性率也高于健康对照组，但总体发生率较低。Selmi等[8]对PBC家系进行研究，发现PBC家系的同卵双胞胎患病的一致率显著高于异卵双胞胎，家族聚集提示遗传易感性在PBC的发病机制中起重要作用。PBC与遗传易感性及环境诱因都可能相关，基因易感性不容忽视。PBC发病率受家庭成员的患病率影响较大，甚至有些儿童也因基因易感性患病。PBC患者的一级亲属患病率大大增加，AMA阳性亲属患PBC的风险较AMA阴性亲属更高[9]。PBC女性患者的一级亲属中女儿患病相对风险最高，我国学者[10]研究发现PBC与HLA等位基因两者之间关系密切，特别是DRB1*0701与疾病易感性显著有关。
同卵双胞胎PBC的发病率高于异卵双胞胎，证实遗传风险的存在，无症状亲属的AMA阳性患者PBC发病率显著增加，高通量遗传学研究增加了人们对PBC基因遗传因素相关性的理解，随着遗传流行病学和高通量测序研究的开展，对PBC发病机制的遗传因素研究越来越深入。SNP低频变异可能与特定疾病的家族聚集现象相关，全外显子组测序(whole exome-sequencing,WES)为PBC家系中SNP低频变异检测提供了技术手段，其高通量测序特性可检测变异频率<0.01的低频变异位点。因此，WES技术可用于家族性疾病的研究，探究低频变异位点[11]。本研究发现母女二人均存在GPSM2、CACNA1S、CRYBA2、SLC7A14、CA13、NOTCH1、PNPLA7、IFT140和BEST2多态性改变，可能与PBC家族易感性有关。
GPSM2是G蛋白信号调节剂2，该基因编码的蛋白属于调节G蛋白激活的蛋白家族，将细胞表面受体接收到的细胞外信号转导为细胞内各种反应。GPSM2突变导致常染色体隐性遗传病Chudley-McCullough综合征，可导致GPSM功能障碍引起的耳聋。研究[12]发现GPSM2表达与乙型肝炎和肝癌密切相关，可能通过促进细胞周期导致肿瘤细胞增殖。CACNA1S是钙电压门控通道亚基α1 S，该基因是编码骨骼肌细胞中缓慢失活的L型电压依赖性钙通道的五个亚基之一。CACNA1S基因的变异与恶性高热易感性和低钾性周期性麻痹等遗传疾病相关。CRYBA2是白内障致病相关基因。SLC7A14是溶质载体家族7成员14，该基因编码一种糖基化的阳离子氨基酸转运蛋白，主要在皮肤成纤维细胞、神经组织和原代内皮细胞中表达。PNPLA7与脂肪细胞分化的调节有关，IFT140基因编码鞭毛内运输复合物A，鞭毛内运输参与初级纤毛的发生、再吸收和信号传导。BEST2是阴离子通道bestrophin基因家族的成员。
NOTCH1编码NOTCH蛋白家族的成员。Notch信号通路是一种进化上保守的细胞间信号通路，在肝脏发育过程中起重要作用。它通过Notch家族受体与其同源配体的结合来调节相邻细胞之间的相互作用。肝脏含有潜能祖细胞，增殖并分化为肝细胞或胆管细胞。尽管成体肝细胞中Notch信号通路活性不高，研究[13]表明无论是在非酒精性脂肪性肝病患者还是小鼠模型中，肝细胞Notch信号通路都会被激活，随后进一步激活肝星状细胞，导致肝纤维化的产生。研究[14]表明胆管结扎后胆汁酸的积累和氧化应激导致炎症反应是诱导肝损伤和肝纤维化的主要因素，胆汁淤积后的肝脏释放促炎细胞因子IL-6、TNFα 和 NF-κB。
IL-6与IL-6R和gp130的六聚体复合物激活Janus激酶(JAK)，进而激活下游信号通路。JAK诱导自身酪氨酸磷酸化及STAT3二聚化，激活Notch信号通路IL-6/STAT3/NOTCH。
在小鼠肝细胞中过表达JAG1将诱导高脂饮食喂养的小鼠肝纤维化，而在小鼠肝细胞中特异性敲除JAG1可以降低肝纤维化程度，表明肝细胞中JAG1-Notch信号通路的激活在肝纤维化过程中起重要作用[15]。JAG1与NOTCH2和NOTCH3受体相互作用导致肝脏祖细胞中Notch信号通路的激活，JAG1是Alagille综合征致病基因，表明Notch信号在胆管稳态中具有重要作用，但这种信号通路的功能研究一直很困难。Zhang等[16]研究表明，在胆汁淤积性肝纤维化中，Notch信号激活肝祖细胞分化为胆管细胞是不可或缺的，Notch 信号增强了胆管细胞的增殖，抑制Notch信号激活后胆管细胞增殖显著减少，肝纤维化程度明显减轻。因此，抑制Notch信号通路可能是治疗胆汁淤积性肝纤维化的方法之一。
PBC病因至今尚未明确，通常认为是环境因素和遗传因素交互作用的结果，但近年研究发现其有一定的家族遗传易感性。本研究通过对同患PBC母女二人进行SNP测序，并根据结果进行分析，发现其有共同的NOTCH1多态性改变，可能是母女共同致病基因，提示对于PBC患者家族一级亲属成员检测NOTCH1多态性有助于确定遗传概率，可能有利于该病的早期诊断及早期干预，但仍需要进一步研究NOTCH1在PBC中的作用机制，为PBC的治疗提供更多的证据。全基因组的研究及进展有望解开遗传和疾病之间复杂的关系，完全解决PBC的发病机制仍有待研究。
伦理学声明：本例报告已获得患者知情同意。
利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：秦玉洁负责文章撰写；
周文秀负责临床资料收集整理；
周兴念负责研究数据的获取分析解释过程；
程明亮、李宏负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。