张温乐，于怡萌，雷轶，戴雪喻，李斌
（上海交通大学医学院上海市免疫学研究所，上海 200025）
调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）是一类高表达白细胞介素（interleukin，IL）-2受体α链（CD25）和转录因子叉头状蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）的CD4+T淋巴细胞亚群。Treg细胞能够调控中枢和外周耐受性，抑制其他免疫细胞的免疫应答，在维持机体免疫稳态中发挥重要作用[1]。大量研究证实，Treg细胞稳态和功能影响一系列自身免疫疾病、急性器官移植免疫排斥的发生、发展。现在Treg细胞疗法包括多克隆Treg细胞疗法、工程化T细胞受体（T cell receptor，TCR）-Treg细胞疗法和嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor-，CAR）-Treg细胞疗法等[2]。目前研究认为，抗原特异性Treg细胞具有抗原特异性，更易于迁移到含有特异性抗原的靶器官，抑制作用优于多克隆Treg细胞[3]。此外，CAR-Treg细胞由于其不受主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制，对IL-2依赖性较低等优点也使得Treg细胞疗法的应用更为广泛[4]。本文对Treg细胞疗法在自身免疫病和器官移植中的应用进行总结和讨论，以期为未来Treg细胞疗法的研究提供参考。
1.1 Treg细胞的可塑性和发育特征
随着单细胞测序技术的发展，Treg细胞被发现在发育过程、组织微环境中具有高度异质性，不同的亚群具有其特殊的分子标志物和状态特征。研究显示，脂肪Treg细胞中高表达ST2或CD73亚型，在脂肪组织响应胰岛素信号和胰岛素抵抗糖尿病发生、发展中发挥重要作用[5]。根据细胞发育与组织分布特征，体内Treg细胞可以分为胸腺中的tTreg细胞，在外周中的由Tcon细胞分化来的pTreg细胞，以及在细胞因子IL-2和转化生长因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）存在时，经由抗原诱导产生的iTreg细胞[6]。相比于其他效应T细胞通过糖酵解途径分化和维持其特定功能，Treg细胞的分化和成熟需要经历FOXP3介导的代谢重编程，从而利用脂肪酸氧化途径产生代谢物和能量[7]。除此以外，Treg细胞中FOXP3的多个转录、表观遗传机制影响FOXP3的转录和蛋白稳定性，例如FOXP3基因上保守的非编码序列CNS2，其中的Treg特异性去甲基化区域能招募FOXP3、CREB等转录因子来稳定FOXP3自身的转录，而乙酰化、泛素化等翻译后修饰机制也能够影响FOXP3的功能和稳定性，从而影响Treg细胞的发育和正常抑制功能[8]。
1.2 Treg细胞的抑制功能
Treg细胞能通过直接抑制和旁观抑制的方式发挥免疫耐受作用。在直接抑制中，Treg细胞以抗原特异性的方式抑制靶细胞；
在旁观抑制中，由于与抗原特异性应答的距离很近，针对一种抗原的特异性Treg细胞也能抑制针对其他抗原的免疫应答，这种抗炎反应能够恢复免疫耐受并维持免疫稳态[9-10]。Treg细胞的抑制功能主要通过细胞间接触依赖的作用机制以及分泌抑制性细胞因子来实现，如通过细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4，CTLA-4）、淋巴细胞活化基因3蛋白（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）等抑制受体直接接触靶细胞或分泌抗炎细胞因子IL-10、IL-35和TGF-β来抑制免疫反应，Treg细胞也通过表面IL-2高亲和力受体CD25与效应T细胞竞争性地结合IL-2，导致效应T细胞缺失存活必需的IL-2信号，进而发生凋亡[11]。另有研究发现，Treg细胞还能通过作用于树突状细胞（dendritic cell，DC），影响DC细胞的成熟和功能表达，干扰T细胞的激活，从而介导免疫抑制[12]。
2.1 Treg细胞回输疗法
Treg细胞回输治疗是将自体Treg细胞体外扩增后回输至患者疾病部位，从而更好地发挥免疫抑制功能以治疗相关疾病。Treg细胞治疗需要大量的细胞进行改造与回输，首要问题就是Treg细胞的来源、纯化与扩增。由于pTreg在Foxp3基因表观修饰和效应分子表达上稳定性更差，并不适合作为细胞治疗的原料；
而通过初始CD4阳性T细胞（Naïve CD4+T细胞）诱导得到的iTreg细胞以及tTreg细胞，在体外也具有良好的增殖能力和稳定的抑制功能，多用于适合细胞治疗的体外扩增，从而获得大量具有抑制功能的Treg细胞，实现细胞回输治疗[13-17]。自体Treg细胞回输已经被证实能改善溃疡性结直肠炎和胆管炎疾病症状[18]；
而在1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）、系统性红斑狼疮等多种自身免疫疾病中进行的临床试验也证实，回输体外扩增的Treg细胞在体内依然具有稳定的抑制能力并能够缓解组织炎症[19-20]。
然而，多克隆Treg细胞回输也存在着一些弊端。首先，为达到相同的治疗效果，相较于单克隆Treg回输，多克隆Treg细胞的回输需要更多的细胞数量；
其次，由于多克隆Treg细胞不针对某一特定的抗原，因此其可能对机体整体的免疫水平产生破坏，从而导致感染或肿瘤风险的增加[21]。如何在保证Treg细胞回输治疗疗效的前提下，确保Treg细胞回输的安全性仍然是一个不小的挑战。
2.2 CAR-Treg细胞疗法
CAR是一种人工受体，它的基本结构由可以特异性结合抗原的胞外段和可以进行信号转导的胞内段组成。近年来，随着人们对T细胞的工程化改造的深入研究，CAR的结构越来越复杂，功能也逐渐强大。CAR最常见的胞外段是单链可变区片段（ScFv），它是由一段连接肽连接起抗体的轻链、重链可变区组成[22]。然而，单链抗体获得的难度较大，限制了上述CAR的应用，因此有研究人员设计了胞外段为自然抗体构型的CAR，它由两条链组成，被称作双链CAR（dcCAR），包含了免疫球蛋白轻链、重链及其恒定区，在一些情况下，这种dcCAR比含单链可变区的CAR更为稳定[23]。此外，最近有研究提出了一种新型的抗原识别区域可变的CAR，即SUPRA CAR，它可以实现在不重新设计CAR的情况下切换抗原识别区域，从而变更靶细胞；
SUPRA CAR应用了一个转接器-标签系统，靶向抗原的特异性抗体上连有通用的标签（往往是生物素/FITC/亮氨酸拉链），而胞外段CAR则是这些标签特异性的抗体，充当“转接器”的作用，通过调节CAR分子对标签的亲和度，可以对其介导的细胞激活强度进行微调[24]。除了对胞外段的改造，发挥信号转导作用的胞内段也经历了更新与优化。第一代CAR的胞内段只包含CD3ζ结构域，第二代CAR在此基础上增添了一个额外的共刺激结构域（CD28或CD137），而第三代CAR则结合了CD28和CD137两个共刺激结构域，激活信号由CD3ζ产生，而共刺激分子则增强了T细胞因子的产生、生存和进一步增殖的能力。第四代CAR在第三代CAR原有功能的基础上还额外增加了调节T细胞分泌细胞因子的功能，作用于CAR-Treg，TGF-β、IL-10等细胞因子，从而增强Treg细胞抑制功能[3,25]。
CAR结构的改造对CAR-Treg细胞的体外增殖和功能表达同样有重要意义。在嵌合抗原受体-传统T细胞（chimeric antigen receptor-conventional T cell therapy，CAR-Tconv）的应用中，抗原非依赖性信号转导会导致进行性的CAR-T失活与耗竭，从而限制CAR-T的功能；
在CAR-Treg中，4-1BB共刺激结构域（co-stimulatory domains，CSD）相关的抗原非依赖性信号转导在细胞激活和增殖方面会产生比CAR-Tconv更显著的影响，且与CD28 CAR-Treg相比，4-1BB CAR-Treg表现出谱系稳定性和抑制能力的下降，但若将4-1BB CAR-Treg在体外扩增过程中短暂暴露于mTOR抑制剂和维生素C中，则可以改善4-1BB CAR-Treg在体内的功能和过继转移后的增殖效果，降低抗原非依赖性信号带来的的负面影响[26]。另外，与自体回输Treg细胞疗法一样，CAR-Treg细胞疗法除了需要工程化改造Treg细胞外，也需要对Treg细胞进行体外诱导和增殖。相关研究表明，在体内CD4+CD25hiCD127lowTreg细胞中存在CD45RA+和CD45RO+两群Treg细胞，表达CD45RO的细胞在后续体外的增殖、诱导过程中的效率和稳定性都强于表达CD45RA的Treg细胞[27]。嵌合抗原受体改造Treg细胞治疗过程及关键点，见图1。
图1 嵌合抗原受体改造Treg细胞治疗Figure 1 Chimeric antigen receptor-modified Treg cell therapy
自身免疫病是指由于免疫细胞识别自身抗原，从而导致免疫耐受和免疫稳态被破坏的疾病。多个研究已经证实，Treg细胞在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、T1DM等自身免疫病中起着至关重要的作用[28-29]。研究发现，Treg细胞主要调控因子FOXP3突变而影响Treg功能，导致免疫功能失调、多发性内分泌病、炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）及免疫失调-多内分泌腺病-肠 病-X连 锁 综 合 征（immunodysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrome，IPEX）等严重的自身免疫疾病[30]。因此，Treg细胞疗法在自身免疫疾病的治疗中具有极为重要的意义，近年来有较多研究聚焦于其在T1DM与IBD方面的应用。
3.1 1型糖尿病
T1DM是一种由于自身免疫细胞识别并破坏胰岛β细胞，导致胰岛素缺乏而产生的自身免疫病。多项研究表明，在非肥胖糖尿病（non-obese diabetic，NOD）小鼠中，胰岛素为自身免疫细胞识别的主要靶标[31]。在T1DM患者中也发现，Treg细胞的免疫抑制功能有一定程度的降低[32]。在NOD小鼠构建的T1DM模型中发现，Treg细胞的发育、功能以及谱系稳定性均发生改变，从而导致了Treg细胞的失能；
NOD小鼠胰岛中浸润的主要细胞群Tbet+Treg细胞的缺失会加速糖尿病的发生，提示其在抗胰岛自身免疫治疗中可能发挥重要作用[33]。
Treg细胞疗法在T1DM的治疗中前景广阔。在T1DM动物模型中，输注扩增的抗原特异性Treg细胞在阻断和逆转糖尿病方面显示出良好的效果[34]。另有研究利用TCR改造的Treg细胞回输，证实了特异性TCR（如谷氨酸脱羧酶、胰岛特异性等）的Treg细胞回输能抑制抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的增殖[35]。但由于TCR改造的Treg细胞疗法的应用受到MHC限制，因此后续研究多集中于开发针对其他糖尿病抗原的CAR-Treg细胞疗法。通过将第二代CAR和FOXP3基因转导到CD4+T细胞的方式可制备胰岛素特异性CAR-Treg细胞。胰岛素特异性CAR-Treg细胞具有与天然Treg细胞相似的表型，并且也能在体外抑制抗原特异性T细胞，但其回输至NOD小鼠后未在体内发现CAR-Treg细胞[36]。因此如何改造Treg细胞，使得CAR-Treg细胞回输后保持稳定性和有效的抑制能力仍需进一步探索。
综上所述，基于Treg细胞的免疫治疗能够重新平衡免疫系统，逆转T1DM的疾病表型，但如何解决Treg细胞功能的复杂性和稳定性，以及找到效果更好、更安全的CAR-Treg细胞疗法仍是未来需要解决的难题。
3.2 炎症性肠病
IBD是以胃肠道慢性炎症为特征的自身免疫病。其中，溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn,s disease，CD）是最常见的IBD类型。在CD中，整个胃肠道的所有层都可能受到炎症的影响，而在UC中，炎症主要发生在结肠黏膜中[37]。研究表明，肠道菌群与免疫反应之间的失衡可能是造成IBD的重要诱因[38]；
其中，Treg细胞在维持肠道免疫稳态中发挥重要作用，而肠道中Treg细胞数量减少与IBD无明显相关性，但是Treg细胞抑制活性缺乏的小鼠更容易产生肠道炎症[39]。
在小鼠肠炎模型中，Treg细胞回输治疗取得了良好的疗效，靶向肠炎抗原的Treg细胞不仅在体外有效抑制了效应T细胞增殖，也在回输治疗后减轻了肠炎症状并且延长了小鼠生存期[40]。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是在结肠炎和结肠癌中表达的抗原。有研究构建了CEA特异性的CAR-Treg细胞，用于治疗结直肠炎和结直肠癌癌症，发现CEA特异性CAR-Treg在体外能保持稳定性和抑制功能，回输后归巢至结直肠部位并减轻了小鼠结直肠炎症状，延长了小鼠生存期[41]。在临床试验中，目前IBD细胞疗法主要是自体Treg回输治疗，CAR-Treg细胞回输还不多见。目前，有两项正在开展的临床试验（NCT04691232和NCT03185000）用于评估Treg细胞治疗IBD的安全性和有效性，方案是通过自体Treg细胞体外扩增后回输[42]。
器官移植是许多器质性疾病后期治疗的最终手段，能够使病人获得更好的预后和生存周期。由于移植器官的免疫原性，受体的免疫系统往往会识别出移植体的非己特征，效应细胞发起针对异体器官的排斥和清除，破坏移植体的结构与机体的稳态；
同时，移植物的免疫细胞也会攻击宿主，产生移植物抗宿主病（graft vursus host disease，GVHD）。
为了获得更好的生存周期与预后，免疫抑制药物被广泛应用于器官移植的免疫耐受维持。免疫抑制药物主要靶向效应T细胞的激活过程——抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）识别与第一激活信号、APC识别与第二激活信号、APC识别与扩增信号等3个环节，从而抑制效应T细胞的活化、增殖及杀伤功能，但在抑制CTL和Teff细胞的同时，Treg细胞也可能相同地受到影响，无法实现精准治疗[43-45]。后续研究中，CD25单抗、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制剂等药物也逐步被作为移植相关的免疫抑制药物，从而增强Treg细胞的抑制功能，提示毒性更低的Treg细胞治疗具有治疗器官移植的可行性和前景[43,46-48]。
Treg细胞作为免疫负调控细胞，能够广泛地抑制先天免疫和适应性免疫的过度活化。多项临床前试验探究了Treg细胞治疗器官移植排斥与GVHD的抑制效果与安全性[49-52]。Trzonkowski等[49]发表了首例Treg细胞治疗GVHD的研究，采集患者外周血中后分离T细胞，体外扩增并按照CD4+CD25+CD127-的标准筛选后回输到急性与慢性GVHD患者体内，从而证实细胞治疗对慢性GVHD患者的治疗效果与优势更加明显，急性GVHD患者症状仅短暂减缓但仍然强于免疫抑制药物。Brunstein等[50]利用第三方的脐带血诱导扩增获得Treg细胞，并扩大了移植实验的例数，证实在脐带血移植的成人中输注Treg细胞不仅不会增加机会性感染和血液系统恶性肿瘤复发的风险，反而提高了患者的生存率，降低了GVHD的发生率。在Treg细胞治疗器官移植的临床前试验中，无论是否利用特异抗原在体外进行扩增刺激，输注到体内的T细胞均会通过TCR受体与体内特异性抗原识别，从而产生特异性的筛选与扩增[53]。然而，多克隆Treg和单克隆Treg群体的治疗效果仍然有所不同，具有同种抗原识别位点的单克隆Treg相比于多克隆Treg具有更强的抑制移植排斥的能力[54-55]。
CAR-T技术的发展促进了利用CAR-Treg细胞治疗移植免疫排斥的临床试验的展开。HLA-A2是引起免疫排斥的主要分子靶点，CAR-HLA-A2 Treg能够显著减弱移植物引起的炎症与排斥，促进机体对移植体的免疫耐受，并且在防止供体T细胞引起的GVHD方面优于多克隆Treg细胞，表明在避免移植排斥方面CAR-Treg细胞治疗具有优势[56-57]。然而，目前利用Treg细胞治疗器官移植的适应人群仍然有限，如果受体发生过供体抗原的初次免疫，移植器官作为二次刺激将引起更强的免疫排斥，此时的CAR-Treg细胞治疗无法减弱再次免疫的强度[56]。相似地，Treg细胞治疗实验中发现了同样现象，记忆T细胞的存在阻止了Treg细胞抑制炎症的作用和耐受建立，而Treg细胞治疗与免疫抑制药物的联用成功减少了排斥反应[58]。
研究显示，Treg细胞治疗能够与传统的免疫抑制药物产生协同作用，通过减少药物的剂量、种类等来降低不良反应，实现药物的早期戒断，为患者提供可持续性的、低毒性的治疗方案[53,58-59]。目前，CAR Treg治疗已经得到较大发展，Sangamo Therapeutics公司快速推动了HLA-A2 CAR-Treg细胞——TX200产品的在体试验，TX200在人源化小鼠上的皮肤移植实验中得到了3个月追踪的良好结果，获得了移植物的免疫耐受并且CAR-Treg细胞表型稳定，近期已开展检测TX200有效性和安全性的临床试验[60-61]。目前，其他开展的Treg细胞疗法相关临床试验如表1所示。
表1 部分Treg细胞疗法相关临床试验Table 1 Some clinical trials related to Treg cell therapy
综上所述，受体对再次免疫的移植物有较强的免疫识别与清除能力，这使得Treg细胞治疗效果不显著，这一现象强调了术前针对移植受体的抗原提呈细胞、记忆细胞、特异性抗体等免疫指标的多方面检测与评估的重要性和必要性。
目前，免疫细胞疗法已经在多种疾病的治疗中崭露头角，尤其是CAR-T细胞疗法在血液瘤治疗中凸显了巨大潜力，CAR-T的技术正在经历优化与提高，其中可替换抗原识别区域的通用的SUPRA-CAR和CRISPR/Cas9技术也为CAR-T的发展提供了新的方向。Treg细胞疗法在自身免疫性疾病和GVHD中显示出的疗效和独特地位使其成为当前免疫细胞疗法研究中的热点。现有的CAR-Treg细胞疗法除了需要解决安全性、稳定性等问题之外，也应该考虑CAR-Treg细胞在特定微环境中的效应情况。未来对CAR-Treg细胞疗法的研究应当根据不同疾病特点，组合不同共刺激因子或细胞因子结构域，调整CAR-Treg细胞的持续性和功能性，从而达到安全、特异并且持续的免疫治疗效果。
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