王涛，张会娜，吴中伟，刘子霞，陈洁
(中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院生殖医学中心，焦作 454000)
冻融胚胎移植(FET)是辅助生殖技术(ART)重要的衍生技术之一，是指采用玻璃化冷冻技术将取卵周期患者未移植的优质胚胎置于液氮中冷冻保存，在适宜情况下，再将冷冻的胚胎解冻复苏进行胚胎移植的助孕技术[1]。在ART获得的妊娠中，生化妊娠、异位妊娠、流产等不良妊娠结局的发生率高达22%[2]，而活产率仍未达到理想要求，使得接受ART的患者仍承受着较大的经济压力和心理压力，因此，早期预测活产率对患者的精神疏导及临床决策都十分重要。本研究回顾性分析2016年1月至2021年6月在我中心行FET的1 741个周期的临床资料，分析与FET活产率具有相关性的预测因子，探讨其预测FET活产率的价值。
一、研究对象
回顾性分析2016年1月至2021年6月在我院生殖医学中心行FET的1 741个周期的临床资料，并根据临床结局分为活产组(794个周期)及非活产组(947个周期)。所有患者在之前进行ART治疗前均知晓并同意将结果用于临床研究。纳入标准：(1)卵巢储备功能尚可，年龄≤50岁；
(2)促排卵方案为激动剂方案、拮抗剂方案及微刺激方案；
(3)夫妻双方染色体核型均正常。排除标准：无随访结果或资料不全者。
二、研究方法
1.内膜准备：根据患者具体情况选择不同的内膜准备方案，合并子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫剖宫产瘢痕憩室及反复宫腔积液、反复移植失败的患者采用降调节人工周期方案；
存在排卵障碍、卵巢功能减退、高龄的患者采用人工周期方案。(1)降调节人工周期方案：患者月经来潮2～3 d，空腹抽血化验性激素六项，彩超监测内膜、窦卵泡数目及大小，给予注射用醋酸曲普瑞林(3.75 mg/支，博福益普生，法国)3.75 mg肌肉注射，14 d后，根据内膜厚度给予戊酸雌二醇片(1 mg/片，拜耳，德国)2～4 mg，2次/d，或雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片(雅培，荷兰，1/10 mg×28片)2～4 mg，2次/d；
当内膜厚度≥8 mm，进行内膜转化[记为第0天(D0)]，给予地屈孕酮片(10 mg/片，雅培，荷兰)口服+雪诺酮(90 mg/支，默克雪兰诺，英国)或安琪坦(0.1 mg/粒，CydeaPharma，法国)阴道给药，用药至移植50 d后，遵医嘱减量，D4移植第3天卵裂胚，D5～6移植囊胚。FET第14天抽血化验β-HCG。(2)人工周期方案：患者月经来潮2～3 d，空腹抽血化验性激素六项，彩超监测内膜及窦卵泡数目、大小，给予戊酸雌二醇片2～4 mg，2次/d，或雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片2～4 mg，2次/d；
当内膜厚度≥8 mm，即为D0转换日，选择地屈孕酮片口服+雪诺酮或安琪坦阴道给药，用药至移植50 d后，胚胎移植同降调节人工周期方案。
2.胚胎培养及冷冻、复苏：取卵后，根据精液情况及上一周期受精情况行常规短时受精或卵胞浆内单精子注射(ICSI)，对于常规短时受精4～6 h，第二极体排出率<30%者，行补救性ICSI(R-ICSI)。受精卵在卵裂胚培养液G-1TMPLUS(瑞利芙，瑞典)中培养到第3天，根据卵裂球数目、卵裂球均一度、胚胎碎片数量与分布、胚胎的色泽与胞浆形态、透明带与卵周隙状态等评估卵裂期胚胎质量。评级为Ⅰ级、Ⅱ级者为优质卵裂胚，Ⅰ级、Ⅱ级及Ⅲ级者为可用卵裂胚。将卵裂胚转移至囊胚培养液G-2TMPLUS(瑞利芙，瑞典)中培养至第5～6天，采用Gardner评分标准进行囊胚质量评估，根据囊胚扩张程度、内细胞团及滋养层细胞质量进行分级。4期及以上、内细胞团或滋养层细胞达到B级及以上为可利用囊胚；
4期及以上、内细胞团和滋养层细胞均达到B级及以上为优质囊胚。选择Ⅰ～Ⅲ级卵裂胚或可利用囊胚严格按照玻璃化冷冻液套装(加藤，日本)说明书及我中心的标准化作业程序(SOP)手册进行胚胎冷冻后置于液氮中保存。FET前严格按照玻璃化解冻液套装(加藤，日本)说明书及我中心SOP手册进行胚胎解冻复苏后置于囊胚培养液G-2TMPLUS中，均采用透明带削薄法进行激光辅助孵化，继续培养2 h后进行移植。
3.FET：结合患者情况及胚胎发育程度，选择至少1枚Ⅰ～Ⅲ级卵裂胚或可利用囊胚进行移植。患者取膀胱截石位，生理盐水冲洗外阴、阴道后，用卵母细胞及胚胎处理液G-MOPSTMPLUS(瑞利芙，瑞典)擦洗宫颈；
在B超引导下，将胚胎移植管(CooperSurgical，英国)的末端轻缓插至距宫底1～1.5 cm处，缓慢注入胚胎后，缓慢拔出胚胎移植管，并在显微镜下确定胚胎移植管内无胚胎残留。术后患者平卧20～30 min，留观2～4 h无不适后即可离院。患者于FET后第14天抽血检测β-HCG值。
4.观察指标及判断标准：收集患者的年龄、体质量指数(BMI)、促排卵方案(激动剂方案、拮抗剂方案及微刺激方案)、不孕年限、不孕类型(原发、继发)、不孕因素(女方因素、男方因素、双方因素、不明因素)、受精方式(IVF、ICSI、R-ICSI)、移植胚胎类型及数量、FET第14天血β-HCG水平及活产率等。
活产指胎儿与母体分离后(不论妊娠期的长短)，具有生命现象(心跳、呼吸、脐带搏动、随意肌缩动)之一者。活产率=活产分娩周期数/FET周期数×100%。
三、统计学处理
一、一般资料比较
本研究共纳入1 741个FET周期，活产794个周期，活产率为45.61%。活产组与非活产组患者的BMI、移植胚胎数量、不孕因素、受精方式、促排卵方案比较无显著性差异(P>0.05)。活产组的年龄、不孕年限显著低于非活产组(P<0.05)，移植日子宫内膜厚度、FET第14天血β-HCG水平显著高于非活产组(P<0.05)。两组的不孕类型、移植胚胎类型比较亦有显著性差异(P<0.05)(表1)。
表1 两组患者一般资料比较[(-±s)，n(%)]
二、FET后活产率相关预测因子分析
单因素logistic回归分析显示，年龄、不孕类型(原发、继发)、不孕年限、内膜厚度、移植胚胎类型(卵裂胚、囊胚)、FET第14天血β-HCG是FET活产率相关预测因子(P<0.05)，详见表2。
以是否活产作为因变量(是=1，否=0)，将单因素logistic回归分析中差异具有统计学意义的临床参数(年龄、不孕类型、不孕年限、内膜厚度、移植胚胎类型、FET第14天血β-HCG)作为自变量进行多因素logistic回归分析(条件法)，结果显示：年龄、FET第14天血β-HCG是FET活产率相关的独立预测因子(P<0.05)，即年龄每增加1岁，活产率变为原来的0.931倍；
FET第14天血β-HCG每增加1 U/L，活产率变为原来的1.003倍，详见表3。
表2 移植后活产率单因素logistic回归分析
表3 多因素logistic回归分析(条件法)
三、相关性分析
Spearman相关性分析显示：FET活产率与年龄的等级相关系数为-0.246，二者呈负相关(P<0.01)，即随着年龄增加，FET活产率降低，但相关性较弱；
FET活产率与FET第14天血β-HCG的等级相关系数为0.734，二者呈中度正相关(P<0.01)。
四、ROC曲线分析
ROC曲线分析表明，年龄的曲线下面积(AUC)为0.358，阈值为26.00岁，敏感度和特异性分别为100.00%、0.32%；
FET第14天血β-HCG的AUC为0.926，阈值为198.91 U/L，敏感度和特异性分别为97.23%、80.25%；
将年龄、FET第14天血β-HCG进行联合检测的AUC为0.922，敏感度和特异性分别为94.33%、82.05%(表4、图1)。且FET第14天血β-HCG与联合检测的AUC(χ2=0.000，P=1.000)、敏感度(χ2=1.047，P=0.306)及特异性(χ2=0.005，P=0.944)比较均无显著性差异，故认为单独检测FET第14天血β-HCG即可较好地预测FET活产率。
表4 ROC曲线分析
图1 ROC曲线
对于新鲜周期不适宜移植或有剩余胚胎的患者，FET可避免再次促排、取卵、受精、胚胎培养等系列复杂过程，有效减少促排卵次数及卵巢过度刺激综合征发生率，显著增加取卵周期的累积成功率及剩余胚胎利用率，且临床妊娠率及活产率与新鲜胚胎移植周期相当[3]。但也有文献报道FET可能引起妊娠期高血压、胎盘形成异常、过期产等风险，进而影响到妊娠结局[4]，给接受FET的患者带来一定的精神压力。因此，早期预测FET的妊娠结局对缓解患者的精神压力、指导临床决策具有重要的意义。
有研究显示，与自然周期相比，采用药物干预的内膜准备方案，其FET后妊娠率、植入率、活产率及多胎率无显著差异[5-6]。故本研究未区分内膜准备方案纳入对象。本研究结果显示：活产组平均年龄及不孕年限显著低于非活产组，单因素logistic回归分析显示年龄、不孕年限是与FET活产率相关的预测因子；
多因素logistic回归分析亦证实年龄是影响FET活产率的独立预测因子。这可能因为高龄与卵巢储备功能下降、子宫内膜变薄、染色体非整倍性增加、纺锤体功能异常、卵母细胞中线粒体数量减少等密切相关，导致低植入率、低妊娠率及高流产率[7-8]。但本研究中ROC曲线提示年龄预测FET活产率的特异性较差。
如何提高活产率、降低多胎率及妊娠期并发症发生率是ART追求的理想目标。囊胚培养可直接淘汰掉发育潜力差的胚胎，且胚胎所处阶段更加符合胚胎着床的生理过程，可以提高种植率及妊娠率，降低多胎率及宫外孕率。但对于获卵数较少的高龄女性，如果全部行囊胚培养，可能面临无胚胎可用的临床结局。因此，对于囊胚培养失败风险较高的患者，可尝试使用卵裂胚进行FET。因此临床工作中应结合患者的个体情况选择移植胚胎类型及数量。国内外关于FET中应用囊胚或卵裂胚移植后妊娠结局的研究结果不尽相同。部分研究结果显示，使用囊胚和卵裂胚行FET的持续妊娠率、分娩孕周、妊娠期并发症、早产和极早产风险及活产率均相似[9-11]。但也有学者认为，与卵裂胚FET相比，囊胚FET的围产儿死亡率及早产率更高[12]。本研究结果显示，活产组与非活产组FET的移植胚胎类型比较有显著性差异(P<0.05)，活产组的卵裂胚移植比例显著低于非活产组，囊胚移植比例显著高于非活产组(P<0.05)，但多因素logistic回归分析提示移植胚胎类型尚不能作为预测FET活产率的独立预测因子。
B超监测子宫内膜厚度是临床评价子宫内膜容受性的最直观指标。有研究指出，厚度<8 mm的子宫内膜不利于胚胎着床，自然流产率高达50%[13]。一般认为子宫内膜厚度为8～14 mm最适宜胚胎植入，且植入率、妊娠率及活产率随着内膜厚度的增加而升高[14]。但Richter等[15]研究发现内膜厚度为6或7 mm时，移植高质量囊胚，妊娠率依然高达50%。因此临床工作中不能仅因为患者内膜薄的单个因素而放弃FET周期。内膜厚度是否能单独作为活产率的预测因子尚存在争议。本研究结果显示，虽然活产组内膜厚度显著高于非活产组(P<0.05)，但其尚不是预测FET活产率的独立预测因子。
本研究对患者的一般资料进行回顾性分析显示，两组患者中原发不孕和继发不孕的分布存在明显差异，非活产组的继发不孕比例显著高于活产组(P<0.05)，但多因素logistic回归分析提示不孕类型无明显预测FET活产率的价值。
女性妊娠期间，树突状细胞因受体刺激会发生损伤胚胎的反应，而滋养层细胞分泌的HCG可保护胚胎不受此损伤[16]，且最早于妊娠第6～8天即可在血清中检测到β-HCG[17]。李玲等[2]研究表明，FET术后第14天，通过检测患者血清β-HCG值可有效预测正常妊娠和异常妊娠(包括生化妊娠、异位妊娠、早期流产等)结局，其敏感度与特异度分别为74.97%、78.21%。邱佩嫦等[18]研究显示，FET后第9天血清β-HCG>79.40 U/L时，单胎妊娠孕妇临床活产率为99.0%；
第9天血清β-HCG>103.00 U/L时，双胎妊娠孕妇临床活产率为83.6%，因此认为FET术后第9天测定血清β-HCG水平对预测单/双胎妊娠活产有参考价值。本研究结果中，经Spearman相关分析，FET后第14天血清β-HCG水平与活产率的相关系数为0.734(P<0.01)，二者呈中度正相关，活产率随着血β-HCG升高呈上升趋势；
且FET第14天血β-HCG水平可用于预测活产率，其阈值为198.91 U/L，敏感度和特异性分别为97.23%、80.25%。但由于检测方法敏感性差异、胚胎种植延迟等因素，导致胚胎移植术后测定血β-HCG预测FET活产率的时间点尚未统一，部分生殖中心检测时间节点为FET后第9天[18-19]，或根据移植胚胎类型选择不同检测时间节点，如移植卵裂胚时间节点选择FET后第14天，移植囊胚时间节点选择FET后第12天[20-21]。我中心则根据《临床诊疗指南 辅助生殖技术与精子库分册》[22]，将血β-HCG检测时间节点统一为FET术后第14天。
综上所述，FET第14天血β-HCG水平与活产率相关，活产率随着血β-HCG水平升高呈上升趋势；
且FET第14天血β-HCG水平可用于预测活产率，其敏感度和特异性均较高。临床工作中，生殖领域医师可以根据移植后血β-HCG水平及时评估患者情况，对可能出现的危险因素采取个体化、针对性的干预措施，以期改善妊娠结局。