毛家英，白玉英，彭麟杰，解 静，田 洋
（1 云南农业大学食品科学技术学院 昆明 650201 2 云南省生物大数据重点实验室 昆明 650201 3 食药同源资源开发与利用教育部工程中心 昆明 650201）
2 型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）是一种严重威胁人类健康的非传染性慢性疾病，是临床上最为常见的糖尿病类型，占所有糖尿病患者的90%～95%。T2DM 的主要特征为持续高血糖，可造成肾、足、眼和神经等多组织脏器损害，并引发多种并发症[1]。世界卫生组织最新公布的权威数据显示，全球糖尿病患者的人数预计到2025年将达到3.7 亿，并且有夸大化和年轻化的趋势。
糖尿病已成为影响人体健康的关键因素，如何医治糖尿病是人类共同面临的问题与挑战[2]。
胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）是T2DM的主要发病原因之一，它是胰岛素靶器官或组织对正常水平的胰岛素敏感性和反应性不足的一种病理状态，主要表现为外周组织，如脂肪、骨骼肌、肝脏组织等对葡萄糖的摄取和利用效率降低[3]。研究表明，胰岛素抵抗贯穿于糖尿病发生、 发展过程，是造成各种慢性并发症的重要病理基础。如何对其进行有效调节是治疗糖尿病的重要靶点之一。此外，大量研究发现，氧化应激是导致IR 的关键因素，已知在发生IR 的大鼠中，肝脏超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和总谷胱甘肽（Glutathione peroxidase，GSH）均显著降低，而代谢产物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）蓄积[4]。
辣木（Moringa oleifera Lam.）为辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，在我国的热带和亚热带地区，如云南、福建、广东等地被广泛种植[5]。
辣木营养价值丰富，且具有较高的药用价值，其各部位如叶、根、种子、树皮、果实、鲜花和未成熟的豆荚等都能入药，具有降血脂、降血压、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝护肾、抗菌和抗病毒等功能[6]。
异硫氰酸酯是一类含有R-N=C=S 结构的化合物，具有杀菌[7]、抗氧化[8]、抗癌[9]及降血糖和降血脂[10]等生物活性。
最新研究表明，辣木叶和辣木籽中富含异硫氰酸酯[11]，具有与其它十字花科蔬菜中的异硫氰酸酯化合物相同的药效团 （R-N=C=S），然而，由于辣木异硫氰酸酯存在芳香环和鼠李糖部分，其在化学结构上与其它异硫氰酸酯化合物有一定区别[12]。辣木异硫氰酸酯（MIC-1）是辣木中含量最高的一种异硫氰酸酯，已有研究证明其具有体外抗炎和抗氧化活性[13]。
此外，大量证据显示MIC-1 可能是辣木调控糖脂代谢的主要活性物质[14-15]。
本研究以MIC-1 为试验材料，研究其对棕榈酸（Palmitic acid，PA）诱导的C2C12 肌管细胞胰岛素抵抗的改善作用，明确MIC-1 调控糖代谢的生物活性。
1.1 材料与试剂
C2C12 成肌细胞从中国科学院昆明动物研究所获得。
辣木籽，云南天佑科技开发有限公司。DMEM 培养基、无酚红DMEM 培养基，Hyclone 公司；
胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、马血清（Horse serum，HS），BI 公司；
青霉素-链霉素、10%SDS、1 mol/L Tris-HCl （pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、BCA 蛋白测定试剂盒，碧云天公司；
牛胰岛素（Insulin，INS），江苏万邦生物医药股份有限公司；
胰酶-EDTA 消化液、细胞裂解液、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、棕榈酸（PA）、 噻唑蓝 （MTT）、 一氧化氮 （Nitric oxide，NO）、微量丙二醛（MDA），solarbio 公司；
葡萄糖氧化酶法测定试剂盒、糖原测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；
丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1（Phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）、蛋白激酶B （Protein kinase B，AKT）、 磷酸化AKT（p-AKT）（Ser407） 和葡萄糖转运蛋白4（Glucose transporter 4，GLUT4）、β-Tubulin 抗体，万类生物科技有限公司；
二抗HRp Rabbit Anti-Goat lgG、HRp Mouse Anti-Goat lgG，ABclonal 公司。
1.2 仪器与设备
多功能酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；
二氧化碳培养箱，苏州贝茵医疗器械有限公司；
细胞计数仪，Invitrogen 有限公司；
倒置荧光显微镜，蔡康光学有限公司；
恒温金属浴，上海一恒科技有限公司；
电子分析天平FA2004，沈阳龙腾电子有限公司；
紫外分光光度计，日本Shimodzu公司；
4 ℃冰箱、-80 ℃冰箱，海尔公司；
Z36HK 型高速台式冷冻离心机，德国Hermle Labortechnik GmbH 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 MIC-1 的制备 辣木籽粉碎后用石油醚去油，以料液比（g/mL）1 ∶60，温度30 ℃，pH 5，时间9 h 的提取条件获得酶解提取液，采用萃取、减压浓缩及重结晶获取纯净晶体，备用，纯度达98%[16]。
1.3.2 C2C12 细胞培养、 传代与分化生长 细胞传代：C2C12 成肌细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长，至80%～90%时进行胰酶消化，终止消化后加生长培养基悬浮细胞，接种传代。
细胞分化：
细胞贴壁生长至80%左右，换为2%HS DMEM 分化培养基继续培养5～7 d，隔天换液，C2C12 成肌细胞90%分化为肌管细胞后进行后续试验[17]。
1.3.3 C2C12-IR 模型建立 将对数生长期的C2C12 成肌细胞以1×104个细胞/孔的密度置于96 孔板中。
待细胞分化为肌管细胞后，立即加入2%FBS 无酚红DMEM 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h，每组8 个平行。
然后用含不同浓度PA（0.25，0.5，0.75 mmol/L）及含100 nmol/L INS 的2%FBS 无酚红DMEM 培养基培养16 h[18]，取上清培养液，采用葡萄糖氧化酶法测定试剂盒检测葡萄糖含量，以空白孔葡萄糖含量减去样品孔葡萄糖含量，计算出各孔葡萄糖消耗量，确定最佳造模浓度。
1.3.4 C2C12-IR 细胞存活率检测 将对数生长期的C2C12 成肌细胞以1×104个/孔的密度接板96 孔板，待细胞分化为肌管细胞后，换含2%FBS的无酚红DMEM 培养基培养12 h。然后用含不同浓 度 MIC -1 （0，0.5，1，2，4，8，16 μmol/L），100 nmol/L INS 和0.5 mmol/L PA 的2%FBS无酚红DMEM 培养基培养细胞16 h。
弃上清，每孔加入100 μL 的0.5 mg/mL MTT 的培养基4 h，弃去培养基，每孔加入100 μL DMSO，在492 nm 波长处测定吸光值，计算细胞存活率。
1.3.5 C2C12-IR 细胞葡萄糖消耗量检测 将对数生长期的C2C12 成肌细胞以1×104个/孔的密度接板96 孔板，待细胞分化为肌管细胞后，换含2%FBS 的无酚红DMEM 培养基培养12 h，按上述方法给药处理细胞16 h，取上清，采用葡萄糖氧化酶法测定试剂盒，检测细胞上清葡萄糖含量，并计算得到葡萄糖消耗量。
1.3.6 C2C12-IR 细胞糖原含量检测 将对数生长期的C2C12 成肌细胞以5×105个/皿的密度接种于5 mm 培养皿，待细胞分化为肌管细胞后，换含2%FBS 的无酚红DMEM 培养基培养12 h，然后用含不同浓度MIC-1 （0，2，4，8 μmol/L）、100 nmol/L INS 和0.5 mmol/L PA 的2%FBS无酚红DMEM 培养基培养细胞16 h。每组设3 个重复，重复3 次。
给药16 h 后，收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤2 次，细胞匀浆后按BCA 法测定蛋白含量，并用硫酸蒽酮法测定各组细胞内糖原含量，按照公式（1）计算肌糖原含量：
1.3.7 C2C12-IR 细胞MDA、NO 含量及GSH 活力检测 将对数生长期的C2C12 成肌细胞以5×105个/皿的密度接种于5 mm 培养皿中，待细胞分化为肌管细胞后，换含2%FBS 的无酚红DMEM培养基培养12 h，按1.3.6 节的给药方式处理细胞，每组设3 个重复，重复3 次。
给药16 h 后，收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤2 次，细胞匀浆后按BCA 法测定蛋白含量，MDA、NO 含量及GSH 活力的测定按照试剂盒说明书操作。
1.3.8 C2C12-IR 细胞PI3K/AKT 通路相关蛋白表达检测 将对数生长期的C2C12 成肌细胞以5×105个/孔的密度接种于5 mm 培养皿中，待细胞分化为肌管细胞后，换含2%FBS 的无酚红DMEM培养基培养12 h，按1.3.6 节的给药方式处理细胞，每组设3 个重复，重复3 次。
给药16 h 后，用预冷的PBS 漂洗细胞，每皿加入100 μL 蛋白质裂解液，在冰上裂解30 min，将细胞刮下收集于1.5 mL 离心管中，12 000×g，4 ℃离心10 min，取蛋白质上清液，BCA 试剂盒测样品的蛋白质浓度。经电泳、转膜、封闭后，4 ℃过夜孵育一抗，常温孵育二抗1 h，显色拍照，通过Image J 软件分析蛋白质条带，定量检测蛋白质表达水平。
1.4 数据统计
试验数据使用Graphpad prism、ImageJ 等软件进行分析统计，各项指标均以“平均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析，* 表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
2.1 C2C12-IR 细胞模型的建立
为了明确C2C12-IR 模型的建立方法，用不同浓度的PA（0.25，0.5，0.75 mmol/L 和100 nmol/L INS 共同处理C2C12 肌管细胞16 h，并以葡萄糖消耗量为检测指标。结果如图1 所示，与对照组相比，INS 组葡萄糖消耗量显著增加 （P<0.01）；
与INS 组相比，不同剂量PA 组葡萄糖消耗量均显著降低（P<0.001），且葡萄糖消耗量从INS 组的8.07 mmol/L 分别降低到4.75 mmol/L （P<0.001），2.87 mmol/L（P<0.001），3.82 mmol/L（P<0.001）。
结果表明，0.5 mmol/L 的PA 诱导的C2C12 细胞胰岛素抵抗程度最强，因此选择0.5 mmol/L 的PA 作用C2C12 肌管细胞16 h 作为最佳建模条件。
图1 不同浓度PA 对C2C12 肌管细胞葡萄糖消耗量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of PA on glucose consumption of C2C12 myotube cells
2.2 MIC-1 对C2C12-IR 细胞存活率的影响
为研究MIC-1 对C2C12-IR 细胞存活率的影响，用不同浓度的MIC-1（0，0.5，1，2，4，8，16 μmol/L）处理C2C12-IR 细胞16 h，然后采用MTT法检测细胞存活率。结果如图2 所示，与对照组相比，INS 增加了细胞的存活率；
与INS 组相比，PA显著降低了细胞的存活率，然而与C2C12-IR 组相比，MIC-1 对C2C12-IR 细胞的存活率没有影响，结果表明，MIC-1 对C2C12-IR 细胞没有毒性。
图2 不同浓度的MIC-1 对C2C12-IR 细胞存活率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of MIC-1 on the survival rate of C2C12-IR cells
2.3 MIC-1 对C2C12-IR 细胞葡萄糖消耗量的影响
为了明确MIC-1 是否具有改善胰岛素抵抗的作用，用不同浓度的MIC-1（0，0.5，1，2，4，8，16 mol/L）处理C2C12-IR 细胞16 h，采用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量。结果如图3 所示，与对照组相比，INS 显著增加肌管细胞葡萄糖消耗量（P<0.001）；
与INS 组相比，C2C12-IR 组葡萄糖消耗量显著降低（P<0.001）；
然而与C2C12-IR 组相比，MIC-1 呈剂量依赖的方式显著增加C2C12-IR 细胞葡萄糖消耗量，且葡萄糖消耗量从C2C12-IR组的4.48 mmol/L 分别增加到6.33 mmol/L（P<0.001），6.47 mmol/L （P<0.001），7.05 mmol/L（P<0.001），9.43 mmol/L（P<0.001）。
以上结果表明MIC-1 具有改善IR 的作用。
图3 MIC-1 对C2C12-IR 细胞葡萄糖消耗量的影响Fig.3 Effect of MIC-1 on glucose consumption in C2C12-IR cells
2.4 MIC-1 对C2C12-IR 细胞肝糖原含量的影响
为了明确MIC-1 是否能促进C2C12-IR 细胞对糖的储存能力，通过对C2C12-IR 细胞糖原含量的测定来确定糖原的合成情况。如图4 所示，与对照组相比，INS 显著增加了肌管细胞糖原含量（P<0.001）；
与INS 组相比，C2C12-IR 组肝糖原含量显著降低（P<0.01）；
然而，用不同浓度的MIC-1（2，4，8 μmol/L） 处 理C2C12-IR 细 胞16 h 后，C2C12-IR 细胞糖原含量显著增加，且具有明显的剂量依赖性，糖原含量从C2C12-IR 组的0.089 mg/mg pro 分别增加到0.094 mg/mg pro（P<0.05），0.109 mg/mg pro（P<0.001），0.14 mg/mg pro（P<0.001）。
结果表明，MIC-1 可通过促进糖原合成提高C2C12-IR 细胞对葡萄糖的摄取利用。
图4 MIC-1 对C2C12-IR 细胞糖原含量的影响Fig.4 Effect of MIC-1 on C2C12-IR cells glycogen content
2.5 MIC-1 对C2C12-IR 细胞氧化应激的影响
如图5 所示，与对照组相比，INS 对C2C12 肌管细胞MDA 水平、NO 水平和GSH 活力没有影响。
与INS 组相比，C2C12-IR 组MDA 水平（P<0.01）和NO 水平（P<0.05）显著升高，GSH 活力（P<0.05）显著下降，表明C2C12-IR 细胞氧化应激增强。
然而与C2C12-IR 组相比，MIC-1 以浓度依赖的方式显著降低了细胞MDA 和NO 水平，且当MIC-1 剂量为8 μmol/L 时，C2C12-IR 细胞的MDA 水平从2.13 nmol/mg pro 降低到0.63 nmol/mg pro （P<0.01），NO 水平从1.08 μmol/L 降低到0.19 μmol/L （P<0.05），GSH 活力从0.14 μmol/mg pro 增加到0.24 μmol/mg pro（P<0.05）。
结果表明MIC-1 能改善IR 的氧化损伤。
图5 MIC-1 对C2C12-IR 细胞氧化应激的影响Fig.5 Effect of MIC-1 on oxidative stress of C2C12-IR cells
2.6 MIC-1 对C2C12-IR 细胞PI3K/AKT 信号通路相关蛋白表达水平的影响
如图6 所示，与INS 组相比，C2C12-IR 组PDK1（P<0.05）、p-AKT（P<0.001）和GLUT4（P<0.05）蛋白表达水平显著降低；
然而与C2C12-IR组相比，MIC-1 剂量为8 μmol/L 时，显著增加了PDK1（P<0.05）、p-AKT（P<0.05）和GLUT4（P<0.05）的蛋白表达水平，结果表明MIC-1 对IR 的改善可能与细胞中AKT 蛋白的磷酸化调节有关，并且MIC-1 通过促进GLUT4 的表达提高细胞对葡萄糖的利用，从而降低血糖。
图6 MIC-1 对C2C12-IR 细胞PI3K/AKT 信号通路相关蛋白表达水平的影响Fig.6 Effects of MIC-1 on the expression of PI3K/AKT signaling pathway related proteins in C2C12-IR cells
研究发现辣木各部位的提取物显示出不同的降血糖作用。
汪芳等[19]发现辣木叶多糖具有降血糖活性，能显著增加HepG2 细胞葡萄糖的消耗量。
吉莉莉[20]发现辣木叶总黄酮中的异懈皮苷具有降低糖尿病大鼠血糖，抑制胰岛素抵抗，改善胰岛功能的作用。Ndong 等[21]的研究发现糖尿病大鼠食用辣木叶粉末后，血糖明显降低，表明辣木叶可以改善葡萄糖耐量。同时研究证明，辣木籽粉及其提取物有一定的降血糖功效，在糖尿病的预防和治疗方面具有巨大研究潜力[22-23]。然而大量的辣木降糖研究均以粗提物为原材料，辣木降血糖的活性成分仍不清楚。
研究发现富含异硫氰酸酯的辣木籽提取物通过调节机体iNOS 和NQO1 等基因表达，从而发挥减轻体重，减少肥胖，改善葡萄糖耐量，减少炎症基因表达和增加抗氧化基因表达的作用[24]。
从新鲜辣木叶制得的富含异硫氰酸盐的辣木浓缩物（含1%～3%异硫氰酸酯）可显著降低肝脂肪、糖异生、胰岛素、胆固醇和炎症标志物的水平[25]。
因此，本研究对于辣木异硫氰酸酯是否有降糖作用提出了设想。
以实验室提取的高纯度MIC-1 为试验材料，通过建立C2C12-IR 细胞模型，明确MIC-1 抑制氧化应激改善胰岛素抵抗的作用，并且其作用机制可能与PI3K/AKT 信号通路有关。
T2DM 是一种与高血糖相关的复杂的代谢紊乱相关性疾病，高血糖会导致线粒体产生大量活性氧、活性氮，在氧化系统中，主要包括超氧阴离子（O2-）、羟自由基（OH-）、过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO-）、过氧化亚硝酸盐（ONOO-）等，进而在不同程度对线粒体功能造成损伤，引起氧化应激反应[26]。
氧化应激状态的显著性特征为氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）水平的升高，ROS化学性质活泼，不易被检测，MDA 是ROS 发生过氧化反应生成的脂质过氧化产物，其水平的高低可以直接反映机体受ROS 攻击的程度强弱以及氧化水平的高低[27]。
在众多的氧化应激指标中，MDA 含量可以直接反映机体脂质过氧化速率和强度，GSH 与SOD 可以显示机体的抗氧化强度，均是反映体内氧化应激水平的经典指标，因此常用于评价机体的氧化应激状态[28]。
在本研究中，MIC-1 能降低氧化物MDA、NO 的含量，同时提高GSH 的活力，结果表明MIC-1 能改善IR 的氧化损伤。
IR 是2 型糖尿病的主要特征，大多数IR 发生在肝脏、骨骼肌和脂肪组织中[29]，骨骼肌是负责葡萄糖代谢的主要外周组织。因此，促进肌细胞葡萄糖消耗成为研究降糖的重要指标。
肌糖原是机体中糖原的一种储存形式，一定程度反映了机体内血糖的平衡情况。
本研究以C2C12 肌管细胞构建胰岛素抵抗模型探究MIC-1 改善胰岛素抵抗的作用，从而探究MIC-1 的降糖作用。
研究发现MIC-1 以剂量依赖性方式增加C2C12-IR 细胞的葡萄糖消耗量。
并且MIC-1 处理C2C12-IR 细胞后发现细胞糖原含量增加，反映了MIC-1 促进C2C12-IR 细胞糖的储存能力。
综上可知，MIC-1能通过促进C2C12-IR 细胞葡萄糖消耗量以及糖原的合成，发挥降血糖作用，并降低氧化应激，改善胰岛素抵抗。
在IR 状态下，骨骼肌对葡萄糖的摄取和利用存在障碍，其分子机制主要是PI3K 信号通路活性的下降，表现为PI3K 活性及AKT 磷酸化水平明显下降。PDK1 和AKT 是PI3K 下游的信号分子[30]。PDK1 被激活后可进一步使AKT 被激活，磷酸化的AKT 将GLUT4 转运到细胞质膜上，从而促进葡萄糖吸收[31]。
在本研究中MIC-1 显著升高了PDK1、p-AKT 和GLUT4 的蛋白表达，刺激PI3K/AKT 通路的信号转导，增强了细胞周围的葡萄糖转运水平。
综上所述，PA 诱导的IR 中，MIC-1 会缓解氧化应激造成的细胞损伤，通过激活PI3K/AKT 信号通路，增加GLUT4 的表达，进而促进细胞对葡萄糖的摄取，从而改善IR。
研究结果可为MIC-1调控糖代谢作用的深入研究提供基础数据，也为辣木资源的深加工奠定科学依据。
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