管 彤, 张 锋
(苏州大学 a.纺织与服装工程学院; b.现代丝绸国家工程实验室,江苏 苏州 215021)
皮肤作为人体最大的器官除了具有感受、分泌、排泄、呼吸等功能,在保护人体免受环境、脱水和传染源侵害方面也起着至关重要的作用[1]。外力、高温、疾病及化学腐蚀可能会破坏皮肤的完整性,造成伤口感染、组织损伤及功能丧失,严重情况下更会危及生命,因而皮肤创伤的有效治疗十分重要。基于组织工程原理引入的伤口敷料可以有效改善临床组织修复效果,在促进伤口修复的同时有效减少疤痕的出现。理想的敷料应具有以下特点:1) 具有一定的柔韧性和强度;2) 透气且不会引起免疫反应,并可抵抗外界微生物的入侵;3) 能在伤口界面保持温和湿润的环境[2]。
丝素蛋白是一种源于蚕丝去除丝胶的两亲性天然高分子材料,由18种氨基酸组成,其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸是其主要组成部分,占总氨基酸含量的75%左右。其一级结构主要由Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser六肽重复序列与非重复序列相间分布而成[3],二级结构主要为Silk Ⅰ和Silk Ⅱ。其中,Silk Ⅰ由无规卷曲和α-螺旋交替堆叠而成,Silk Ⅱ主要由反平行β-折叠组成。研究表明,丝素蛋白结构与其材料性能密切相关,因此可以通过结构调控丝素蛋白材料的降解、力学、生物相容性等性能[4]。
蚕丝作为医用缝合线的使用已有几十年的历史,因其优良的打结性能而深受临床医生的认可与欢迎。随着对蚕丝结构特征与物化性质研究的深入,其在生物医学领域的应用受到越来越多的关注。丝素蛋白经再生加工后可以形成薄膜、多孔海绵、水凝胶、纳米纤维膜等支架,更好地满足各种组织修复的需要。丝素蛋白的高透气率和高吸氧率、优异的机械性能、良好的生物相容性、可降解性、易于塑形等特点,使其在创面修复领域中受到研究者的青睐。近年来,丝素蛋白敷料被成功开发,并被中国批准用于临床创面修复。为加速创面愈合,提升创面修复效果,通过丝素蛋白材料结构性能设计与优化,或与活性因素结合用于创面修复的研究取得了重要进展。本文综述了丝素蛋白作为创面敷料的功能特性,并重点阐述活性丝素蛋白敷料在创伤修复中的研究现状与进展。
1.1 免疫反应
植入生物材料应尽量避免或减少免疫和组织反应的发生。大量的体外与体内实验表明,丝素蛋白具有较低的免疫原性和组织反应性。这种低免疫反应表现为不易激活免疫细胞(如巨噬细胞)、不引起炎症因子释放、较低的体内排异反应等。丝素蛋白在植入体内的初始阶段会引起轻度的炎症反应,有利于破坏损伤部位存在的病原体,促进机体的生长因子释放,有助于伤口修复。Panilaitis等[5]研究了巨噬细胞对丝素的反应,表明丝素的低炎症潜能是基于促炎细胞因子TNFα的释放。丝素蛋白在植入初期的炎症反应会很快消退,不存在发展为慢性炎症的风险[6]。丝素蛋白中富含的氨基酸能够激活巨噬细胞JNK-STAT信号通路,介导巨噬细胞发生M2极化行为,从而降低植入部位的炎症反应[7]。Rnjak-Kovacin等[8]发现,与2周相比,4周后皮下植入的丝素蛋白多孔支架内浸润的免疫细胞显著减少。丝素蛋白水凝胶皮下植入2周内可见巨噬细胞和中性粒细胞,4周后这些免疫细胞急剧减少,12周后免疫细胞消失[9]。因此,作为一种低免疫反应的生物材料,丝素蛋白材料体内植入后可以为宿主组织修复提供支持。
1.2 止血性能
生理性止血主要由血管收缩、血小板血栓形成和血液凝固三个过程组成。止血材料的止血机制是在血管收缩的基础上,通过血小板黏附与聚集、凝血因子浓缩实现快速高效止血的效果。作为一种生物材料,丝素蛋白本身即具有一定的止血功能。丝素蛋白通过溶解或溶胀黏附于伤口并物理封闭创面,从而达到止血作用。丝素蛋白还可以吸附并浓缩血液中的有效成分,如凝血因子、血小板等促进止血过程。此外,丝素蛋白直接激活凝血因子或血小板进而激活凝血系统,通过血栓发生达到止血效果。温壮壮[10]利用核黄素交联形成非晶高溶胀丝素蛋白水凝胶,利用高溶胀特性快速封堵创面血管。Kundu等[11]研究发现丝素蛋白可以显著缩短凝血时间,与明胶相比可以缩短50%左右,深入分析发现丝素蛋白通过活化血小板发挥促凝活性。Teuschl等[12]将纤维蛋白原、凝血酶与蚕丝溶液混合形成的活性丝素蛋白材料实现了快速高效止血,从而加快伤口愈合。因此,为了进一步提高丝素蛋白的止血性能,可以通过丝素蛋白结构设计、多成分复合、凝血因子负载等实现。
1.3 再上皮化
再上皮化是皮肤伤口愈合极为重要的一个环节,主要包括角质形成细胞的迁移、增殖和分化三个阶段。已有研究证实,丝素蛋白可促进成纤维细胞纤连蛋白和血管内皮生长因子的表达,激活NF-κB信号通路,促进伤口再上皮化,从而诱导伤口愈合[13]。丝素蛋白中存在促上皮化的活性物质,Abdel-Naby等[14]使用含有可溶性丝素蛋白的滴眼液治疗兔角膜上皮损伤,研究结果显示,显著提高了上皮细胞增殖、角膜上皮损伤的快速愈合及角质上皮再生。因此,丝素蛋白优良的生物性能为细胞提供了一个良好微环境,有助于角质形成细胞的迁移,促进伤口的早期再上皮化,减少伤口愈合的时间。
1.4 血管新生
血管生成是创面愈合的必要条件,因此促进血管新生成为生物医用材料研究与开发的热点之一。为了促进血管化,生物材料须具备适宜的成分、形态、结构与力学性能。丝素蛋白膜对全皮层缺损有较好的修复效果,显示了较好的血管化作用[15]。现有多项研究证明,丝素蛋白通过促进血管新生加速了伤口愈合。Samal等[16]的体外细胞实验证明,共培养在丝素蛋白三维支架上的人内皮细胞和包皮成纤维细胞可以形成血管样结构。Stoppato1等[17]将丝素蛋白纤维混入聚乳酸盐浸海绵支架后,发现该复合支架不仅更有利于体外内皮细胞的生长,而且促进了体内的血管化进程。Chouhan等[18]将丝素蛋白水凝胶用于烧伤创面,发现丝素蛋白水凝胶与未经治疗的伤口相比,其血管密度高出10倍。Wang等[19]研究发现,丝素蛋白中混合丝胶蛋白可以通过激活巨噬细胞,特别是提高M2型巨噬细胞的比例以促进血管化。因此,丝素蛋白作为一种生物材料,具有促进毛细血管生成的特性,有利于其在创面愈合中的应用。
2.1 纯丝素蛋白敷料
丝素蛋白具有良好的生物相容性,但缺少生物活性,这限制了其在生物医学领域的应用。针对目标组织的结构特征,通过材料的结构与性能设计可取得更好的修复效果,如取向结构用于神经修复[20]、高压缩模量用于骨组织工程[21]。在创面修复方面,丝素蛋白支架的结构设计与性能调控同样可发挥积极作用。Lu等[22]对自组装丝素蛋白纳米纤维进行电场处理,制备了各向异性的丝素蛋白纳米纤维多孔支架,研究发现支架的各向异性结构可提高细胞的迁移效率,促进组织向内生长、表皮新生、胶原沉积,以及更快的伤口闭合。Wrayls等[23]采用微加工和软光刻技术在丝素蛋白支架内引入微通道来模拟微血管分布,体外细胞实验结果发现这些微通道促进内皮细胞增殖、VEGF分泌及血管样结构形成,这些体外形成的血管样结构体内植入后与宿主血管吻合,加速血管浸润,为移植干细胞与组织生长提供及时和充分的营养物质。
支架力学性能是影响细胞功能与组织再生的一个重要因素,有研究认为压缩模量为1～7 kPa的材料更有助于血管形成[24]。Han等[25]通过添加酸来调节丝素蛋白的自组装结构,得到了水不溶且压缩模量为5 kPa左右的支架,研究发现该支架在不添加生长因子的情况下可以体外促进干细胞向内皮细胞分化,体内促进血管新生和组织生长,成为一种具有促进血管化性能的活性丝素蛋白支架。与以往的研究不同,该纳米纤维支架主要由Silk Ⅰ结构组成,具有柔软的力学性能和促血管化能力。为了更精确地调控丝素蛋白支架力学性能,Lu等[26]将结晶与非晶的丝素纳米纤维混合,再结合冷冻温度控制丝素二级结构,成功将丝素支架力学性能调控为3～7 kPa,并发现机械强度为5.7 kPa的支架促血管化性能最佳,然而其韧性未能满足应用需求。Guo等[27]结合冷冻温度和有序结构双因素制备了力学性能为2 kPa和5.9 kPa的丝素支架,增强了材料的韧性,研究发现5.9 kPa的丝素支架具有更好的促血管化性能,同时可促进细胞的迁移与增殖。因此,通过取向结构设计、微通道整合、力学性能优化来提升丝蛋白支架的活性,具体表现为促进细胞增殖与迁移,促进血管样结构形成与血管新生等,从而提升创面修复效果。
2.2 丝素蛋白复合敷料
纯丝素蛋白材料在创面修复中存在成分、结构、性能方面的不足,通过与天然或合成高分子材料复合可以赋予材料更多潜能[28]。壳聚糖是一种碱性、带正电荷的天然多糖,具有良好的生物相容性、生物降解性和抗菌能力,被广泛应用于皮肤组织工程。采用静电纺丝制备的丝素/壳聚糖二维复合纳米纤维膜不仅具有良好的抗菌性能,而且更有利于人角质细胞的黏附与铺展[29]。在形成自组装丝素纳米纤维的基础上,Ding等[30]利用冷冻干燥技术制备了在成分与纳米结构方面双仿生的复合支架,该复合支架在体外可以促进干细胞增殖,体内促进血管新生与组织长入。此外,除了原材料复合,还可通过支架表面修饰优化其性能。Guang等[31]在多孔丝素蛋白支架上涂敷壳聚糖制备的复合支架,实现了无疤痕无感染的大鼠创面修复。
角蛋白、聚乙烯醇、海藻酸钠、芦荟胶、胶原蛋白、透明质酸等与丝素复合后均对伤口愈合起到促进作用。Bhardwaj等[32]采用冷冻干燥制备了丝素蛋白与人角蛋白三维复合支架,研究发现角蛋白的加入提高了丝素蛋白支架的力学性能,同时促进成纤维细胞的黏附与增殖,特别是促进细胞分泌更多I型胶原。丝素蛋白与弹性蛋白的复合可以更好地模拟细胞外基质结构与性能,该复合支架支持人皮肤成纤维细胞的正常增殖,促进三度烧伤创面的快速愈合,效果与商业用胶原膜相近[33]。海藻酸钠与弹性蛋白相比,不仅能快速吸收水分并维持湿润密封环境,还具有清洁伤口的作用,避免伤口感染发炎。基于丝素蛋白与海藻酸钠的复合支架,发现可以通过上皮细胞的快速增殖促进大鼠伤口愈合,取得了与临床用敷料相近的伤口愈合效果[34]。以上研究表明,基于丝素蛋白制备的复合支架具有更加优良的结构性能与生物学特性,适合用于创面组织修复。
2.3 丝素蛋白负载生长因子
创面修复是一个复杂的生物学过程,涉及多种生长因子的参与和调控,如表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等[35]。通过在丝素蛋白支架上负载生长因子可以赋予支架更多生物活性,从而实现更好的创面修复效果[36]。
VEGF是急性创面愈合早期必需的生长因子之一,在肉芽组织中通过毛细血管增殖提升再内皮化的速度[37]。Song等[38]采用新型的轮纺技术制备了负载VEGF的海藻酸钠和丝素蛋白复合纤维材料,研究发现基于溶液浓度与纤维形态的设计可实现VEGF的可控释放,该材料有望用于创面治疗。EGF不仅可以诱导角质形成细胞的迁移和上皮化,还可以产生细胞因子和胶原蛋白,保持皮肤的拉伸强度[39]。通过静电纺丝技术制备出的丝素蛋白纳米纤维材料对生长因子有着很好的亲和性,有利于生长因子的负载。Chouhan等[40]采用静电纺丝技术开发了EGF和盐酸环丙沙星功能化的丝素蛋白敷料,体外细胞实验表明该敷料可促进成纤维细胞和角质形成细胞的增殖,体内创面经敷料覆盖后可促进皮肤细胞外基质中成熟弹性蛋白、胶原蛋白和网状纤维的沉积,实现创面无疤痕愈合。
单因子装载难以应对创面复杂的微环境,如糖尿病慢性难愈创面仍是临床难题。Chouhan等[41]采用静电纺丝技术将含有RGD序列的柞蚕丝和聚乙烯醇加工成纳米纤维膜,并负载两种生长因子(EGF和bFGF)及抗菌肽(LL-37),体外细胞实验发现该支架可显著提高细胞迁移效率,体内糖尿病皮肤缺损实验证明该支架支持更快的肉芽组织发育、血管生成和再上皮化。此外,在复合支架中发现有组织结构的细胞外基质沉积(I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、网状蛋白)和更高的伤口断裂强度。由于生长因子对组织生长的强调节作用,其在丝素蛋白支架上的负载可以取得即时的生物学效应,因而成为提高丝素蛋白生物活性及创面修复效果的有效策略。
2.4 丝素蛋白负载药物
暴露的创面不仅面临复杂的体内微环境,同时面临体外环境干扰,药物的使用可以更好地促进创面愈合。丝素蛋白除了拥有良好的生物学特性,还是优异的药物载体,可以更好地保持药物活性并实现药物的精准递送[42]。例如,与以溶液和粉末形式相比,青霉素和四环素等抗生素载于丝素蛋白膜中表现出更高的稳定性[43]。
创面愈合是一个复杂的过程,即使伤口愈合之后仍然有可能形成严重的疤痕,对患者的外貌心理皆易造成影响,为了解决这一问题,可在敷料上负载针对性的药物缓减疤痕。Liu等[44]将疏水性药物积雪草苷装载到丝素纳米纤维水凝胶中用于全层皮肤缺损修复,实现了无疤组织再生。该方法通过简单的混合离心,达到了更高的药物装载效率,优于早期研究报道的积雪草苷负载系统。然而,从水凝胶中释放出的积雪草苷含量较少,且持续时间较短。Ding等[45]以自组装丝素蛋白纳米纤维水凝胶负载去铁胺(DFO),利用纳米纤维与DFO之间的强物理结合力实现DFO零级释放达40 d以上。该水凝胶通过DFO的持久释放刺激血管生成,促进细胞迁移及组织向内生长,并减弱药物的细胞毒性,最终促进创面更好的愈合。
感染是创面修复中的另一难题,一旦发生会大幅延缓愈合进度,甚至危及生命。因而,许多研究集中于开发抗菌抗感染的丝素蛋白敷料。Yerra等[46]通过静电纺丝技术制备负载抗生素(环丙沙星、阿莫西林和制霉菌素)的丝素蛋白/聚乙烯醇复合纳米纤维膜用于治疗烧伤创面,研究发现该材料对烧伤创面脓液感染病原菌具有抗菌敏感性,可有效治疗创面感染,促进细胞的增殖和创面愈合。为了同时实现抗感染和创面修复,采用抗感染药物及纳米银进行修饰,用于增强敷料的广谱与长久抗菌性。Zhang等[47]对丝素、甘草酸和银进行化学交联,制备出具有抗菌性能的丝素/银/甘草酸复合水凝胶敷料。该水凝胶结合了丝素良好的生物活性、银和甘草酸的抗菌活性,能够促进伤口愈合过程中的组织再生。银纳米颗粒和甘草酸的协同作用赋予了丝素蛋白更优异的抗菌抗感染性能,将提高伤口愈合进程。
2.5 丝素蛋白联合干细胞
干细胞具有自我更新和多向分化能力,还能分泌多种活性因子,调节免疫反应和细胞微环境,促进组织再生,在创面修复中发挥重要作用[48]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有优良的生物学特性,能满足创面修复中的多种需要,因而具有潜在的应用前景[49]。然而,干细胞在注射过程中的剪切应力造成的干细胞损伤,及其在伤口部位的滞留性差等问题,影响了干细胞的治疗效果。最近,Li等[50]将BMSCs负载到剪切变稀的丝素纳米纤维水凝胶中并将其注射到伤口部位,研究发现这不仅可以保持细胞干性,促进伤口愈合相关基因的表达,且有利于血管生成,提高胶原沉积和毛囊再生,加速伤口的愈合再生。然而,BMSCs存在数量少、来源受限、采集过程痛苦等缺陷。近年来,月经血源间充质干细胞(MenSCs)作为一种新型的间充质干细胞受到人们的关注,可通过从人子宫内膜月经出血中简单获得,与其他类型的干细胞相比,该干细胞具有更强的增殖、归巢和血管生成能力,能满足临床对种子细胞的多重需求[51]。Mirzadegan等[52]将MenSCs植入由羊膜和丝素蛋白纳米纤维组成的双层支架中,与直接注射MenSCs或单独应用支架相比,能更有效地促进慢性创面的愈合过程。
2.6 其 他
随着科学技术的进步,丝素蛋白敷料的开发也更加多样化。3D生物打印技术已可实现对生物大分子和细胞的精确定位,提供功能性全层人工皮肤移植。基因工程技术也使转基因蚕产生了含有生长因子多肽的蚕茧[53]。Wu等[54]利用转基因技术,获得了表达人表皮细胞生长因子(hEGF)蛋白的转基因家蚕,该蚕吐出的丝素蛋白不仅无细胞毒性,而且显著促进人成纤维细胞的增殖。近年来,添食育蚕法因具有操作简单、可大规模生产、绿色环保的优点而受到关注,如喂食碳纳米管与石墨烯获得高强度蚕丝[55],喂食纳米银获得抗菌蚕丝[56]。基于丝素蛋白的微针敷料技术也同样受到关注,使用该技术可开发出实现传感与药物递送的智能敷料。Gao等[57]研发了一种智能丝素微针敷料,该敷料具有智能药物释放、生化传感和生理监测能力,可用于表皮传感和伤口愈合。这些新技术的出现势必为智能敷料的开发带来新的启示,也为开发功能活性丝素蛋白敷料提供新思路。
创伤修复是一个复杂的过程,依赖于细胞、生长因子及其与生物支架间的相互作用。丝素蛋白可促进细胞黏附、再上皮化和止血,降低免疫反应,加速创面修复的进程,在促进伤口愈合中发挥着重要作用。丝素蛋白作为一种生物材料已被广泛研究与应用,并显示出各种类型伤口治疗的潜力。进一步通过丝素自身结构设计与性能优化及生长因子、药物、干细胞等其他生物活性分子的联合使用,对丝蛋白材料进行功能化改性,将增强丝蛋白敷料的功效,有望开发出高效修复、降低疤痕组织生成的丝素蛋白基活性创伤敷料。
近年来,随着微制造技术的发展,出现了智能生物活性敷料的新概念,智能伤口敷料的出现引发了学者们越来越多的关注。但目前在生物智能敷料的研发上尚待进一步深入,当伤口环境中破坏性细胞因子水平升高时,生物智能敷料需要能够在伤口部位传递生物活性化合物,并与伤口环境产生主动的、动态的相互作用。此外,生物智能敷料还需要通过实时分析伤口渗出物的生理信号,监控伤口及周围环境。然而,在临床实践中,这些功能性敷料还面临着许多挑战。未来的研究可以将生物活性丝素蛋白敷料与智能敷料相结合,在实现功能化的基础上进一步实现智能化,即与伤口环境动态的相互作用,伤口的实时可视化监测,这将有望为创伤的临床修复治疗提供一种全新的方案。
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