张哲，张雷，段诗苗，江浩
食管癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于胃癌，食管瘤患者发现时多数属于中晚期，相当一部分患者失去了手术机会，放射治疗成为重要的选择。尽管放射治疗技术不断更新，放射设备不断进步，但放射抵抗仍然是食管癌放疗效果不好的重要原因[1-2]。PLOD2(5-双加氧酶)如何参与激活食管癌放射抵抗基因的机制尚不完全清楚。PLOD2蛋白是存在于粗面内质网中的功能性酶，能够促进上皮间质转化(EMT)过程，研究[3-4]表明，PLOD2通过肿瘤细胞膜表面的钙离子依赖性跨膜糖蛋白的介导从而激活P-gp(P-glycoprotein)表达。P-gp阳性的肿瘤细胞可以不同程度地抵抗多种射线的杀伤，抑制放射线的凋亡效应，从而引发放射抵抗而导致放射治疗失败。本研究发现食管癌PLOD2表达不同对放射治疗的反应是不同的，初步探讨了PLOD2表达与食管癌放疗预后之间的临床关系。
1.1 一般资料 收集蚌埠医学院第一附属医院放疗科2012年1月—2017年1月行纤维食管镜活检证实为食管鳞状细胞癌患者的石蜡组织标本，入组患者176例均进行根治性放疗，放疗剂量根据患者的具体情况，在45-60GY之间，均完成了治疗计划。均能随访，失访者排除，未能完成治疗计划的患者也排除。年龄最小者28岁，年龄最大者91岁，中位年龄67岁。2组患者的临床特征比较。见表1。
表1 2组患者临床特征比较
1.2 方法 主要试剂鼠抗人PLOD2单抗来自美国Santa Cruz，Elivison Plus试剂盒来自迈新生物技术开发有限公司，检测PLOD2所需要的病理材料来源于病理科存档的石蜡包埋组织标本，免疫组织化学ElivisionTM Plus法检测,免疫组化染色，采用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照，病理检测PLOD2表达情况，观察分析2组患者临床转移情况、放疗后3月临床近期有效性、患者1、3、5年的总生存率间的差异，分析PLOD2阳性表达组与PLOD2阴性表达组患者生存预后之间的关系。
1.3 结果判定
1.3.1 PLOD2阳性表达判定 PLOD2主要表达于细胞质，强阳性部分细胞核也会表达(见图1)，使用半定量法对染色面积进行评分：0分，无染色;1分，染色10%; 2分，染色10%～30%;3分，染色30%。染色强度：0分，无; 1分，淡黄色; 2分，黄色; 3分，棕黄色。
总分为染色面积和染色强度得分的乘积，总分≤3分定义为阴性表达，总分>3分定义为阳性表达。所有免疫组化的切片都由两位经验丰富的病理科医生独立评分，通过联合评估对分歧结果进行校正。
1A PLOD2阳性表达(SP×100倍) 1B PLOD2阳性表达(SP×400倍) 1C PLOD2阴性表达(SP×100倍) 1D PLOD2阴性表达(SP×400倍)图1 PLOD2在食管癌组织中的表达情况
1.3.2 临床效果的判定 (1)临床转移情况和放疗后3月临床近期有效性的判定，根据食管造影、超声检查、CT、MRI、ECT或者pet-CT等影像资料，部分患者采取穿刺组织学活检取得病理结果等资料按照影像学诊断指南标准判断，部分缓解(PR)为肿瘤缩小≥50%，持续1月以上。完全缓解(CR)为胸前上肿瘤完全消失，持续1月以上。有效率=(PR+CR)例数/总例数。(2)生存率是患者接受放射治疗结束后存活满1、3、5年的人数与总人数的比率。
1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，计数资料以n，%表示，采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 2组患者临床转移情况比较 PLOD2阳性表达组在疾病的临床发展过程中出现远处脏器转移率高于PLOD2阴性表达组，无临床转移率低于PLOD2阴性表达组，差异有统计学意义(P<0.05)；
PLOD2阳性表达组淋巴结转移及局部侵犯率高于PLOD2阴性表达组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
2.2 2组患者放疗后临床近期有效性比较 放疗3月后全面临床复查，PLOD2阳性表达组临床近期有效率低于PLOD2阴性表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
2.3 2组患者1、3、5年生存率比较 PLOD2阳性表达组患者1、3、5年生存率均低于阴性表达组患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。
表2 2组患者临床转移情况比较
表3 2组患者放疗3月后临床近期有效率比较
表4 2组患者1、3、5年生存率比较
部分食管癌患者在确诊时，因肿瘤生长部位不适合手术或病情发展已丧失了手术时机，多采取以放疗为主的综合治疗或者单纯放疗。近年来随着同期放化疗的应用，食管癌患者5年生存率有了较大提高，但2年生存率仍低于40%，治疗失败的主要原因是局部未控制和复发(30%～50%)[1-2]。肿瘤细胞放射敏感性是影响放疗效果的主要生物学因素，寻找预测食管癌放疗预后指标是实现食管癌个体化、高效放疗的关键。
放射治疗作为食管鳞状细胞癌有效治疗方法之一，因放射抵抗导致一部分患者疗效降低。放射治疗通过高能射线与物质作用时，物质中的电子从原子或分子轨道转移发生电离，正是这一机制导致肿瘤细胞发生物理化学改变，破坏肿瘤细胞的DNA结构。放射治疗对于进入有丝分裂周期中的细胞，有较好的杀伤作用，但对静止的G0期细胞杀伤作用较差。尽管有各种方法诱导G0期细胞进入有丝分裂周期，仍未从根本上解决放射抵抗问题。对于已经进入分裂周期的部分肿瘤细胞，没有产生致死性损伤，对于亚致死性损伤和潜在致死性损伤的肿瘤细胞一定时间内在适合的条件下可以修复损伤，重新获得增殖能力。在这个修复过程中PLOD2起到了重要的促进作用，同时PLOD2可能是激活食管鳞状细胞癌放射抵抗基因的一个重要原因。有研究[5-6]报道PLOD2通过肿瘤细胞膜表面的钙离子依赖性跨膜糖蛋白的介导从而激活P-gp(P-glycoprotein)表达，P-gp是由多药耐药基因MDR1编码的一种能量依赖跨膜糖蛋白，P-gp阳性的肿瘤细胞可以不同程度地抵抗多种射线的杀伤，P-gp通过稳定线粒体电位，使肿瘤细胞线粒体通透性上调，从而抑放射线的凋亡效应，引发放射抵抗而导致放射治疗失败。
PLOD2的表达与多种肿瘤的发生、发展、转移及预后有密切关系[7-9]。PLOD2异常高表达与食管鳞状细胞癌的发生有一定的关系，也是促进食管鳞状细胞癌扩散、转移的一个重要因素。本研究发现，食管鳞癌PLOD2阳性表达组患者的病理分化程度较阴性表达组患者更低，临床分期更晚，且PLOD2阳性患者放疗后远处脏器转移率高于阴性患者。同时，PLOD2阳性患者放疗有效率低于阴性患者。上皮间质转化是指上皮细胞在某些因素作用下获得了迁移和运动等间质细胞的功能[10-12]。PLOD2的作用机制主要是胶原蛋白在分泌到细胞外形成胶原纤维之前，需要在细胞内质网中进行一系列的翻译和修饰过程，其端肽区赖氨酸残基经赖氨酸羟化酶催化而发生羟基化。原胶原赖氨酸，2-酮戊二酸，5-双加氧酶(PLOD2)蛋白的主要功能是羟基化胶原蛋白端肽区赖氨酸残基，并在细胞外形成相互交联稳定和抗张力大的吡啶链结构，促进肿瘤细胞外基质重构，增加硬度，从而促进肿瘤的侵袭转移。PLOD2的表达上调，促进了Slug和Axl的表达，从而诱导EMT的过程，同时也使得miR-205的表达下降，而miR-205可以抑制Zeb1和Vimentin的表达，其对于Zeb1和Vimentin的抑制减弱，Zeb1和Vimentin也是上皮间质转化的重要促进因子[13-14]，通过细胞外调节蛋白激酶信号通路激活食管鳞状细胞增殖。PLOD2的表达上调促进上皮间质转化，从而上皮细胞在某些因素作用下获得了迁移和运动等间质细胞的功能，肿瘤细胞分化程度变差，PLOD2阳性表达往往分化程度低，这也是PLOD2阳性表达组放射治疗后预后差的一个重要因素[15-16]。本研究发现，食管鳞癌PLOD2阳性表达患者的放疗后1、3、5年生存率均低于阴性表达患者。
提高食管癌放疗敏感性，减少放疗抵抗是提升食管癌放疗预后的重要难题。本研究揭示了PLOD2阳性表达是食管鳞癌放疗后预后不良的指标，但是，本研究作为一项单中心回顾性研究，可能存在选择偏移，同时患者以皖北地区人群为主，具有地域局限性，所以仍需多中心大样本的回顾性研究进一步支持本研究的结论。总之，PLOD2表达水平的不同对食管癌放疗预后会产生不同的影响，为预判食管癌放疗的预后提供了新的依据，为食管鳞癌寻找到一个新的可能预测放射敏感性的分子靶点。
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