李佳潞，党 辉，杨梦洁，梁鑫宇，穆明月，刘馨雨，张海生
（陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西西安 710100）
柿子（Diospyros kakiLinn.f.） 属于柿科（Ebenaceae），柿属（Diospyros kaki）[1]，原产于中国。中国是世界上生产柿子栽培面积最大的国家，占世界柿子栽培面积的91%，其产量占世界总产量的73%[2]。主要产地分布在山东、陕西、云南、河南、河北等地区[3]，有8 000 多种[4]。柿子根据口味可分为甜柿和涩柿两大类[5]，我国栽培的柿子主要为涩柿。
柿子含有丰富的维生素、矿物质、还原糖、多糖、纤维素和果酸等营养物质和单宁、黄酮等活性成分，被誉为“果中圣品”。传统的中医认为，柿子具有清热解毒[2]、补虚[6]、健胃、滋养等功能，可以辅助治疗高血压、慢性支气管炎[2]等疾病，对恶心、眩晕、肿胀[2]等不适症状也有一定的效果。现代研究表明，柿子中含有丰富的单宁和黄酮等多酚类物质，具有清除自由基[7]、止血、杀菌、免疫调节[8]、预防癌症、抗突变[9]、使人体血压维持在正常水平、预防动脉硬化、治疗黄褐斑[10]等作用，还具有防晒、美白[7]功效。对13 个品种柿子的多酚、黄酮和单宁的含量、活性进行比较研究，以期为柿子的开发利用提供参考。
1.1 仪器
MultiskanGo 型全波长酶标仪，美国Thermo 公司产品；
L420 型低速离心机，湘仪离心机公司产品；
HH-S4 型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；
BILON-650CT 型多用途恒温超声波提取机，西安比朗生物科技有限公司产品；
GZX-9146 MBE 型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备产品；
JA2003N 型电子天平，冠森生物科技有限公司产品；
HDM-1000C 型数显恒温电热套，常州荣华仪器制造有限公司产品；
722 型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品。
1.2 试剂
标准品：单宁酸、没食子酸（98.5%），AR，上海源业生物科技有限公司提供；
芦丁（95%） BR，上海源业生物科技有限公司提供。
试剂：1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼（DPPH），Sigma 公司提供，氢氧化钠、硝酸铝、硝酸铝、硝酸铝、饱和碳酸钠、福林-酚试剂和无水乙醇等其他试剂，均为国产分析纯。
1.3 材料
1.3.1 涩柿
牛心柿（别名水柿）、四棱柿，采摘于陕西省西安市鄠邑区；
五花柿、尖柿，采摘于陕西省咸阳市彬县；
板柿、镜面柿、君迁子，采摘于陕西省渭南市蒲城县；
金瓶，2018 年10 月23 日采摘于陕西省汉中市华阳镇；
黑柿，采摘于陕西省汉中市西乡县；
小萼子，采摘于山东省潍坊市临朐县。
1.3.2 甜柿
次郎，采摘于陕西省西安市鄠邑区；
阳丰、中冒盖，采摘于陕西省汉中市西乡县子午镇。
2.1 柿子多酚和黄酮的提取
参考王燕等人[11]的方法，稍作修改。选取不同品种柿子各5 个，在每个柿子上取样1.00 g，每个品种的柿子共称量5.00 g，于研钵中研磨，直至其为糊状，倒入烧杯中，向烧杯中加入体积分数为50%的乙醇溶液70 mL，加入质量分数为1%的盐酸溶液1 mL，放入60 ℃恒温水浴锅中，提取120 min，过滤，得到滤液，定容至100 mL 容量瓶中，以转速4 000 r/min 离心6 min，作为多酚和黄酮的待测液。
2.2 柿子单宁的提取
按照崔翠等人[12]的方法，稍作修改。选取不同品种柿子各5 个，在每个柿子上取样1.00 g，每个品种的柿子共称量5.00 g，于研钵中研磨，直至其为糊状，倒入烧杯中，向烧杯中加入体积分数80%的乙醇溶液80 mL，摇一摇。放在水浴锅中，设定温度为90 ℃，120 min后取出，凉水冲洗瓶身，冷却至室温，将柿子匀浆倒入容量瓶中，定容至100 mL，静置5 min，取上层清夜，采用离心机以转速3 000 r/min 离心8 min 后，取上层清夜，作为单宁的待测液。
2.3 柿子抗氧化活性提取液的制备
参考孙兴荣等人[3]的方法，采用乙醇提取法，选取不同品种柿子各5 个，在每个柿子上取样1.00 g，每个品种的柿子共称量5.00 g，于研钵中研磨，直至其为糊状，倒入烧杯中，加入体积分数为70%的乙醇溶液80 mL，振荡摇匀。将匀浆置于水浴锅中，设置温度为50 ℃，水浴50 min 后，冷却至室温，于100 mL 容量瓶中定容，静置5 min，取上清液。用离心机离心，以转速4 000 r/min 离心6 min。然后取上层清夜，作为抗氧化活性的待测液。
2.4 柿子总酚含量的测定
2.4.1 没食子酸标准曲线绘制
参考陈佳歆[13]的方法，采用标准曲线法，测定13 个样品中黄酮的含量。精密称取没食子酸标准品100 mg，放在烧杯中，加蒸馏水充分溶解，在容量瓶中定容至100 mL，得到1 mg/mL 的标准没食子酸工作液。依次吸取没食子酸标准工作液，0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于10 mL 试管中，加入福林-酚试剂0.5 mL，室温下黑暗反应5 min；
加入质量分数为7.5%碳酸钠溶液0.4 mL，用蒸馏水定容至10 mL，室温下黑暗反应60 min 后，于波长765 nm 处测定吸光度A，制作标准曲线，得回归方程为Y=0.004 2X+0.033 5，R2=0.980 5。
2.4.2 样品的测定
吸取待测样品液2 mL，测定方法同标准曲线的没食子酸。每个样品进行3 组平行试验，通过标准曲线计算样品总酚含量，结果以1 g 干样品中没食子酸的质量表示。
2.5 柿子总单宁的测定
2.5.1 FoLin-Denis 试剂的配制
准确称取钨酸钠100.00 g，磷钼酸20.00 g，用量筒量取50.00 mL 的磷酸，全部加入到750 mL 蒸馏水中，回流2 h 后冷却至室温，稀释定容至1 L。
2.5.2 单宁酸标准曲线绘制
参考李鹏等人[14]的方法。精密称取单宁酸50.0 mg，放在烧杯中，加蒸馏水溶解，置于容量瓶中，定容至50 mL，摇匀，得质量浓度为1 mg/mL 的标准溶液。分别吸取单宁酸标准溶液，0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于10 mL 试管中，加入FoLin-Denis 试剂0.5 mL，饱和碳酸钠溶液1.0 mL；
蒸馏水定容至10 mL，摇匀后，置于室内30 min，于波长650 nm处测得吸光度A，制作标准曲线，得回归方程为Y=0.004 4X+0.015 5，R2=0.988 3。
2.5.3 样品的测定
将待测样品稀释10 倍，吸取1.0 mL 稀释的样品液，测定方法同标准曲线的单宁酸。每个样品进行3组平行试验，通过标准曲线计算样品单宁含量，结果以1 g 干样品中单宁酸的质量表示。
2.6 柿子黄酮含量的测定
2.6.1 芦丁标准曲线绘制
参考陈佳歆[13]的方法。精确称取芦丁标准品0.1 g，烧杯中溶解后，在100 mL 容量瓶中定容，得到芦丁标准工作液。将芦丁标准工作液稀释10 倍，得到质量浓度为0.1 mg/mL 的芦丁工作液，依次吸取稀释10 倍后的芦丁标准工作液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于10 mL 试管中，加入25 mg/mL 的亚硝酸钠溶液2.0 mL ，室温静置反应6 min；
加入质量浓度为50.0 g/mL 的硝酸铝溶液2.0 mL，室温静置6 min；
最后加入质量浓度为0.16 g/mL 的氢氧化钠溶液2 mL，室温静置，10 min 后，用蒸馏水定容至10 mL，于波长510 nm 处测定吸光度A，制作标准曲线，得回归方程为Y= 0.034 6X+0.019 7，R2=0.982 5。
2.6.2 样品的测定
吸取待测的样品液0.5 mL，测定方法同标准曲线的芦丁。每个样品进行3 组平行试验，通过标准曲线计算样品黄酮含量，结果以1 g 干样品中芦丁的质量表示。
2.7 柿子提取液DPPH 清除率的测定
2.7.1 DPPH 试剂的配置
参照《多肽抗氧化性测定DPPH 和ABTS 法》（GB/T 39100—2020） 国家标准，配置DPPH 溶液；
准确称取DPPH 5.0 mg，用适量无水乙醇溶解，在30 ℃下，避光超声处理5 min，完全溶解后取出，定容至100 mL，制备成50.0 μg/mL DPPH 溶液。溶液应现场配制和使用。
2.7.2 预试验
对于一个样品，取3 支试管，分别编号为1，2，3；
在1 号试管中，加入无水乙醇溶液1.0 mL，DPPH 溶液3mL；
在2 号试管中，加入稀释后的样品溶液1.0 mL，无水乙醇溶液3.0 mL；
在3 号试管中，加入稀释后样品溶液1 mL，DPPH 溶液3 mL。
试剂添加好后，充分混合摇匀，室温下避光反应，30 min 后，于波长517 nm 处测定吸光度，通过1 号试管得到的吸光度记为Ac；
通过2 号试管得到的吸光度记为Aj；
通过3 号试管得到的吸光度记为Ai；
按公式（1） 计算清除率，根据不同样品的清除率，为每个样品设置不同样品的浓度梯度，使每个样品的清除率都可以通过纵坐标为50%的点。
2.7.3 样品的测定
根据预设，对每个样品设置不同浓度梯度，取不同浓度梯度的待测样品溶液，加无水乙醇至1 mL，加入DPPH 溶液3.0 mL，充分混合均匀后，室温避光反应30 min，于波长517 nm 处测定吸光度，记为Ai。
柿子提取液DPPH 清除率按下列公式计算：
式中：Aj——样品自身的吸光度；
Ac——DPPH 本身吸光度；
Ai——样品对DPPH 作用后的吸光度。
2.7.4 IC50值的计算
按照任飞[15]的方法，以一个样品的不同浓度梯度为横坐标，以DPPH·清除率为纵坐标，做DPPH·清除率的曲线，按照非线性回归的方法，计算当DPPH·清除率达到50%时的质量浓度。即为IC50值。
3.1 13 个柿子品种的总酚含量
13 个柿子品种的总酚含量见图1。
图1 13 个柿子品种的总酚含量
由图1 可知，柿子品种间的总酚含量差异很大，10 个涩柿品种中，君迁子的总酚含量最高，含量为0.163 mg/g，牛心柿的最低，含量为0.125 mg/g；
3 个甜柿品种中，次郎的总酚含量最高，含量为0.151 mg/g，阳丰的最低，含量为0.094 mg/g。13 个柿子品种总酚含量由高到低的顺序为君迁子＞板柿＞镜面柿＞四棱柿＞次郎＞小萼子＞黑柿＞金瓶＞尖柿＞五花柿＞牛心柿＞中冒盖＞阳丰。
3.2 13 个柿子品种的总单宁含量
13 个柿子品种的总单宁含量见图2。
图2 13 个柿子品种的总单宁含量
由图2 可知，柿子品种间单宁含量差异很大，涩柿的单宁含量显著高于甜柿（p＜0.05）。10 个涩柿品种单宁平均含量为2.182 mg/g，3 个甜柿品种单宁平均含量为0.491 mg/g。10 个涩柿品种中，单宁含量差异也很大，君迁子的单宁含量最高，为4.496 mg/g；
金瓶的单宁含量最低，为1.329 mg/g。3 个甜柿品种中，中冒盖的单宁含量最高，为0.627 mg/g；
阳丰的单宁含量最低，为0.42 mg/g。13 个柿子品种的单宁含量由高到低的顺序为君迁子＞黑柿＞板柿＞镜面柿＞四棱柿＞小萼子＞五花柿＞牛心柿＞尖柿＞金瓶＞中冒盖＞次郎＞阳丰。
3.3 13 个柿子品种的黄酮含量
13 个柿子品种的黄酮含量见图3。
图3 13 个柿子品种的黄酮含量
由图3 可知，柿子不同品种间的黄酮含量差异很大，10 个涩柿中，镜面柿的黄酮含量最高，为0.96 mg/g，尖柿的含量最低，为0.24 mg/g；
3 个甜柿品种中，次郎的黄酮含量最高，为0.28 mg/g；
涩柿的黄酮含量高于甜柿，10 个涩柿品种黄酮含量的平均值为0.48 mg/g；
3 个甜柿品种黄酮含量的平均值为0.25 mg/g。13 个柿子品种的黄酮含量由高到低的顺序为镜面柿＞黑柿＞四棱柿＞五花柿=板柿＞牛心柿＞君迁子＞小萼子＞金瓶=次郎＞尖柿=中冒盖=阳丰。
3.4 13 个柿子品种的抗氧化活性
3.4.1 柿子提取液对DPPH 自由基的清除能力
柿子提取液的DPPH 自由基清除率见图4。
由图4 可知，柿子不同品种DPPH 自由基的清除能力差异很大，清除能力与浓度呈正相关。13 个品种中，君迁子的DPPH 自由基的清除能力最强，0.5 mg/mL 的清除率为80%；
中冒盖的清除能力最弱，25 mg/mL 的清除率只有68%。涩柿的DPPH 自由基清除能力强于甜柿，这和柿子中的多酚、黄酮和单宁的含量有关，多酚、黄酮和单宁含量高，抗氧化能力强。13 个柿子品种的抗氧化能力由大到小的排列顺序为君迁子＞黑柿＞四棱柿＞镜面柿＞板柿＞牛心柿＞小萼子＞尖柿＞金瓶＞五花柿＞阳丰＞次郎＞中冒盖。
图4 柿子提取液的DPPH 自由基清除率
3.4.2 柿子提取液对DPPH 自由基的IC50值
IC50可以表示对自由基清除能力的大小，若IC50值比较小，则该抗氧化剂有很强清除自由基的能力，相应的，其抗氧化能力也越强。
柿子提取液对DPPH 自由基的IC50值见表1。
由表1 可知，君迁子对DPPH 自由基的清除能力最强，其IC50值为0.21 mg/mL；
中冒盖对DPPH自由基的清除能力最弱，其IC50值为17.8 mg/mL。涩柿的IC50值显著低于甜柿，说明涩柿的抗氧化活性显著高于甜柿。
表1 柿子提取液对DPPH 自由基的IC50 值/mg·mL-1
不同柿子品种的多酚、黄酮、单宁含量和抗氧化活性存在显著差异，涩柿的总酚、总单宁和总黄酮含量高于甜柿，抗氧化活性强于甜柿。君迁子是13 个柿子品种中总酚和单宁含量、抗氧化活性最高的品种，开发前景好。
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