代金彩，李 丽,2，李学涛，魏 杰，聂竹兰
( 1.塔里木大学 动物科学学院，新疆建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，塔里木珍稀鱼类研究中心，新疆 阿拉尔 843300；
2.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300 )
宽口裂腹鱼(Schizothoraxeurystomus)属裂腹鱼属，又名宽口臀鳞鱼[1-2]，与其他裂腹鱼比较其显著特征为下颚有角质，主要分布于新疆阿克苏河、木扎提河、克孜尔河、渭干河、叶尔羌河[3]。因人为活动干扰、环境变化、其自身繁殖力低下等影响，宽口裂腹鱼的数量急剧减少。新疆维吾尔自治区拟将其列为保护鱼类[4]。目前，宽口裂腹鱼的研究主要集中在其种群生态学[5]、形态学[6]、生物学[7]等方面，还有少量关于其RNA及线粒体基因的研究[8]，但关于其细胞培养系建立的研究尚未见报道。细胞培养技术是体外人工模拟体内环境，细胞经过大量培养成简单的单细胞或极少分化的多细胞的技术。1962年建立了世界上第一株鱼类细胞系——虹鳟(Oncorhynchusmykiss)性腺细胞系RTG-2[9]。1981年建立了我国第一个鱼类细胞系——草鱼(Ctenopharyngodonidellus)吻端组织细胞系[10]。目前，我国建立的鱼类细胞系已超过70种，以淡水鱼类细胞系为主[11]。鱼类细胞系建立后可应用于病毒学、细胞生物学、环境毒理学等领域[12-13]。鳍条组织本身具有很强的再生能力，细胞迁出成功率高，同时取鳍条组织时无需将鱼处死，因此有很多鱼类细胞系建立都是来源于鳍条组织，如红鳍东方鲀(Takifugurubripes)鳍细胞系[14]、石鲽(Kareiusbicoloratus)鳍细胞系[15]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)鳍条细胞系[16]、绿腹丽鱼(Etroplussuratensis)尾鳍细胞系[17]。
水体中盐碱度水平对鱼类的存活有显著的影响，盐碱度过高或过低均会使鱼类的存活率显著降低[18-19]。在盐度为20时，尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)仅少数个体能存活至96 h，碱度为12 g/L(以NaHCO3计)时，96 h全部死亡[20]；
盐度为5.0～22.1时，小黄鱼(Larimichthyspolyactis)10 d内存活率极高，随着盐度降低或者升高，小黄鱼的存活率持续下降[21]。
笔者拟建立塔里木裂腹鱼尾鳍组织细胞系，测定以NaCl模拟的盐度和NaHCO3模拟的碱度对其相对增殖率的影响，以期为保护其种质资源及探究其耐盐碱机理提供基础数据。
1.1 试验鱼
2019年9月在克孜勒河采捕野生宽口裂腹鱼，饲养于新疆建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，取健康宽口裂腹鱼，体质量92.88 g、全长18.54 cm。
1.2 试验试剂
DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640、M199培养基购自Hyclone公司；
胎牛血清购自Gibco公司；
磷酸盐缓冲液、青霉素-链霉素双抗、二甲基亚砜购自Solarbio公司；
台盼蓝和0.25%胰酶购自Biotopped公司；
麻醉剂(MS-222)购自渔夫宝公司；
基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；
其他化学试剂均为分析纯。
1.3 试验方法
1.3.1 原代培养与传代培养
取宽口裂腹鱼，注入0.1 μL/g的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐进行麻醉。剪取上尾鳍，用75%乙醇清洗。取4个培养皿，其中1个培养皿中加75%乙醇，另3个培养皿均加入含有500 IU/mL的青霉素和500 μg/mL的链霉素的磷酸盐缓冲液。剪取尾鳍鳍末端组织，放入75%的乙醇浸泡30 s后，依次放入另外3个培养皿中浸泡1 min。经处理的尾鳍组织放入2 mL无菌离心管中，用无菌眼科剪刀剪至1～2 mm3的组织碎块。在已剪好的组织碎块中加入0.25%胰酶溶液消化组织2 h，收集消化的组织离心，用磷酸盐缓冲液冲洗3次。将消化的组织移入25 cm2细胞培养瓶，放入25 ℃的CO2培养箱中，观察贴壁情况，过4 h后反相放置。6 h后，加入1 mL含20%胎牛血清、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL链霉素的DME/F12培养液，正相放入25 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。每日观察组织生长的情况。2～3 d更换1次培养液，当细胞密度达106个/mL时按照1∶2进行传代培养。第5代后，将培养液中的链霉素质量浓度、青霉素含量和胎牛血清体积分数分别调整为200 μg/mL、200 IU/mL和15%，第8代后，培养液换为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DME/F12培养液。
1.3.2 细胞生长曲线
将一定密度的第10代细胞接种在24孔板上，分成8组，每组6孔，接种一定密度的细胞进行连续7 d的常规培养，用血球计数板进行计数，每日记为1组，分析数据并绘制细胞生长曲线。细胞生长曲线的纵坐标为每日计数的细胞平均数量，横坐标为时间。根据下式计算出细胞的群体倍增时间[22]：
T=t×lg 2/lg (nt/n0)
式中，T为群体倍增时间，nt为细胞培养时间t后的细胞数，n0为接种细胞数。
1.3.3 细胞最佳生长条件的选择
用传至第6代的细胞。使用4种培养基DME/F12、L-15、MEM和RPMI-1640。设置20、25、30、37 ℃ 4个温度梯度。设置0、10%、20%、25% 4个胎牛血清体积分数。分别在不同条件下培养0、24、48、72、96 h，用血球计数板对细胞进行计数，并绘制不同条件下细胞的生长曲线。
1.3.4 细胞冻存与复苏
冻存：配制含20%磷酸盐缓冲液、70% DME/F12和10%二甲基亚砜的细胞冻存液，置于4 ℃冰箱中进行预冷以备用。取生长旺盛的细胞，经离心去掉上清液，加入磷酸盐缓冲液再次重悬，再次离心去掉上清液，重复操作3次。取沉淀并加入细胞冻存液，重悬，调整细胞密度至2.0×106个/mL，并转至冻存管中。
复苏：取冻存40、90和180 d的第6代细胞，于25 ℃水浴锅快速解冻，操作台内将细胞转移至15 mL离心管，逐滴加入5倍体积的预冷培养液，悬浮细胞，离心弃上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬，再次离心弃上清液，重复3次。取适量细胞采用台盼蓝染色，进行细胞计数并计算存活率；
加入10 mL培养液，置于25 ℃、5% CO2培养箱中培养，细胞复苏36 h后需首次换液。
1.3.5 细胞污染与检测鉴定
选用观察法与PCR法检测细胞是否被细菌、真菌、支原体污染。所用引物见表1。细菌、真菌的DNA模板为环境中细菌、真菌培养样品提取所得，作为阳性对照组，支原体DNA模板为新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室赠予。PCR扩增细菌DNA，25.0 μL反应体系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1.0 μL，5.0 μL模板DNA，5.5 μL的灭菌超纯水。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次。PCR扩增真菌DNA，25.0 μL反应体系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1.0 μL，5.0 μL模板DNA，5.5 μL的灭菌超纯水。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次。PCR扩增支原体DNA，25.0 μL反应体系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1.0 μL，2.0 μL模板DNA，8.5 μL的灭菌超纯水。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；
94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环34次。PCR扩增反应结束后，取8.0 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
表1 通用引物序列
1.3.6 细胞来源鉴定
用基因组DNA试剂盒提取宽口裂腹鱼尾鳍细胞DNA。根据宽口裂腹鱼线粒体16S rRNA设计引物(表2)。通过PCR扩增，50.0 μL反应体系：25.0 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各2.5 μL，5.0 μL模板DNA，15.0 μL的灭菌超纯水。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，48.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环35次。PCR扩增反应结束后，取8 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。PCR产物测序，比较并获得与GenBank中已发表序列的一致率。
表2 16S rRNA基因的PCR扩增和序列引物
1.3.7 盐碱度对宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率的影响
以NaCl模拟盐度环境，设置NaCl质量分数1‰、2‰、4‰、6‰、8‰和10‰ 6个梯度。称取NaCl溶质加入DME/F12培养液溶解，溶解后溶液再用0.22 μm过滤筛过滤。
以NaHCO3模拟碱度环境，设置NaHCO3质量浓度2、3、4、5、6、7、8、10 g/L 8个梯度。称取NaHCO3溶质加入DME/F12培养液溶解，溶解后溶液再用0.22 μm过滤筛过滤。
细胞铺板：取第6代对数生长期的宽口裂腹鱼尾鳍细胞系细胞用含体积分数为10%胎牛血清DME/F12培养液调整密度为1×104个/mL的细胞悬液，铺置于96孔培养板上，每种材料铺6孔。每孔加入100 μL细胞悬液，25 ℃、5% CO2培养箱培养12 h后。按分组分别加入不同含量盐碱试剂，每孔20 μL，空白对照组不加试验试剂为0，其他条件同试验组。继续培养24、48、72 h。之后将每个含液体孔加入噻唑蓝20 μL后继续培养4 h，小心吸出各孔内液体后每孔加入150 μL二甲基亚砜。摇床摇培养板20 min，酶联免疫检测仪490 nm波长条件下测定各孔光密度值[D(490 nm)]。细胞相对增殖率(R，%)的计算公式如下：
R=D(490 nm)试验组/D(490 nm)对照组×100%
1.4 数据分析
SPSS 20软件包对结果数据进行统计学分析，数据以平均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，显著性水平设为0.05。
2.1 宽口裂腹鱼尾鳍细胞原代培养与传代培养
每天观察细胞瓶，第3天后，宽口裂腹鱼的尾鳍组织块周围开始迁出细胞，由组织块向周围溢出；
第6、12天细胞继续迁出；
第16天，细胞呈悬浮生长，当细胞密度约为106个/mL时按照1∶2进行传代培养，每天观察细胞生长状况，生长速度较快(图1)。
图1 宽口裂腹鱼尾鳍细胞原代培养
2.2 宽口裂腹鱼尾鳍细胞生长曲线
绘制宽口裂腹鱼尾鳍细胞生长曲线(图2)。接种一定数量的细胞，在最适条件下生长，在1～4 d时细胞生长的速度较快，5～6 d时生长速度放缓趋于平稳，之后细胞数量下降。经计算，细胞群体倍增的时间为24.94 h。
图2 宽口裂腹鱼尾鳍细胞生长曲线
2.3 宽口裂腹鱼尾鳍细胞最佳生长条件
宽口裂腹鱼尾鳍细胞在L-15、MEM、RPMI-1640和DME/F12培养基中同条件培养96 h。当培养基是MEM、RPMI-1640时，宽口裂腹鱼尾鳍细胞基本不生长；
在L-15培养基中，细胞进入指数期延迟；
DME/F12培养基生长趋势最好，最佳培养基为DME/F12。在温度20、25、30 ℃下，细胞生长均比较好，25 ℃生长最好；
当温度升至37 ℃时，细胞生长状态明显的低于20、25、30 ℃下的生长状态。
在体积分数0%、10%、20%、25%胎牛血清中同条件培养，除在0%的血清中生长较缓，在10%、20%和25%的血清中均生长较好，20%中生长最好(图3)。
图3 宽口裂腹鱼尾鳍细胞生长的胎牛血清条件
2.4 宽口裂腹鱼尾鳍细胞冻存与复苏
宽口裂腹鱼尾鳍细胞冻存复苏后，经台盼蓝染色，进行细胞计数并计算存活率，重复10组取平均值。对第6代细胞液氮冷冻保存后，复苏经台盼蓝染色并计数统计，180 d后复苏存活率达(88.72±0.99)%(表3)，90 d和180 d存活率差异不显著(P>0.05)。180 d后细胞复苏，细胞具有活性，且复苏后增殖速度快(图4)，可正常传代(图5)。
表3 冻存后复苏的存活率
图4 噻唑蓝法测定复苏细胞增殖
图5 宽口裂腹鱼尾鳍细胞复苏培养
2.5 宽口裂腹鱼尾鳍细胞污染与检测鉴定
宽口裂腹鱼尾鳍细胞中提取细菌、真菌、支原体DNA，经过PCR法鉴定细菌、真菌、支原体污染。1、3、6泳道分别为细菌、真菌、支原体PCR产物阳性对照，2、4、5泳道分别为尾鳍细胞中提取细菌、真菌、支原体的DNA进行PCR的产物，样品均无与阳性对照组一致的条带，表明样品中无细菌、真菌、支原体，宽口裂腹鱼尾鳍细胞未被污染(图6)。
图6 细菌、真菌、支原体PCR鉴定结果
2.6 宽口裂腹鱼尾鳍细胞来源鉴定
基因组DNA试剂盒提取宽口裂腹鱼尾鳍细胞DNA，经PCR扩增，在琼脂糖凝胶中电泳检测，PCR产物目的条带大小符合16S rRNA的大小(图7)。经测序后的序列片段与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。尾鳍细胞同源性与GenBank中发布的宽口裂腹鱼线粒体基因(NC036933.1)的序列达到99.91%的一致率，在第1522位点有1个位置发生突变(图8)。
图7 宽口裂腹鱼尾鳍细胞16S rRNA基因PCR扩增产物
图8 宽口裂腹鱼尾鳍细胞系测序序列和宽口裂腹鱼16S rRNA序列(NC036933.1)比对分析
2.7 噻唑蓝法检测不同盐质量分数下的细胞增殖情况
2.7.1 NaCl质量分数对宽口裂腹鱼尾鳍细胞增殖的影响
在NaCl质量分数一致情况下，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系的相对增殖率随时间延长而下降，由此可知，NaCl质量分数对宽口裂腹鱼尾鳍细胞系增殖的抑制可随时间延长而增强。在同一时间点上，1‰、2‰、4‰、6‰、8‰ NaCl依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率上升，8‰、10‰ NaCl依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率下降，8‰ NaCl时相对增殖率最高，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率随NaCl质量分数增加呈先升后降的趋势(表4)。
表4 NaCl质量分数对宽口裂腹鱼尾鳍细胞系增殖的影响(平均值±标准差)
2.7.2 NaHCO3质量浓度对宽口裂腹鱼尾鳍细胞增殖的影响
在NaHCO3质量浓度一致情况下，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系的相对增殖率随时间延长而下降，由此可知，NaHCO3质量浓度对宽口裂腹鱼尾鳍细胞系增殖的抑制可随时间延长而增强。在同一时间点上， 2、3、4、5、6、7 g/L NaHCO3依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系细胞相对增殖率上升，7、8、10 g/L NaHCO3依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率下降，7 g/L NaHCO3时宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率最高，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系增殖随NaHCO3质量浓度增加呈先升后降趋势(表5)。
表5 NaHCO3质量浓度对宽口裂腹鱼尾鳍细胞系增殖的影响(平均值±标准差)
3.1 宽口裂腹鱼尾鳍细胞系的建立
笔者以宽口裂腹鱼尾鳍组织为材料，用组织块移植法进行了宽口裂腹鱼尾鳍组织细胞原代培养，命名宽口裂腹鱼尾鳍细胞系。宽口裂腹鱼尾鳍细胞系在20%胎牛血清的DME/F12培养液中生长良好。细胞培养常用的培养液有L-15、MEM、RPMI-1640和M199，但不同的鱼类对环境要求不尽相同，因此，不同鱼类的最适培养基亦不同。褐点石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus)鳍细胞系[26]、真鲷(Pagrusmajor)细胞系[27]的最佳培养液为DMEM/F12。笔者选用DEM/F12、L-15、MEM和RPMI-1640培养液作为试验培养液，结果表明，DME/F12为最佳培养液。鱼类组织细胞生长温度范围与哺乳类组织细胞比较，适宜温度范围较广。宽口裂腹鱼尾鳍细胞系在20～30 ℃细胞均能正常生长，其中25 ℃为最适生长温度，与已报道真鲷和圆斑星鲽(Veraspervariegates)的细胞温度适应范围一致[27-28]，这与鱼类是变温动物有很大关系。在0%、10%、20%和25%的体积分数胎牛血清培养基中同条件培养，在未加血清的培养基中的生长速度显著低于添加血清的培养基，在20%胎牛血清时生长最快，胎牛血清体积分数对细胞生长有明显的影响，与已报道的研究相似[29]。
宽口裂腹鱼尾鳍细胞系呈悬浮生长。贴壁培养型的细胞，细胞膜表面含有大量黏附因子。这些黏附因子可激活不同的信号通路调节贴壁细胞的活性和增殖，如整合素活化黏着斑激酶激活信号通路抑制细胞内源性的凋亡[30-31]。悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞等血液系统来源的细胞，这种细胞体积小，缺乏黏附分子的表达[32-33]。用物理方法进行贴壁型细胞的悬浮驯化时使细胞产生失巢凋亡[34]，无血清与生物反应器驯化使贴壁细胞产生失巢凋亡的拮抗[34]。Ana等[35]用舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)肠细胞研究其失巢凋亡。猜测宽口裂腹鱼尾鳍细胞呈悬浮生长的状态，可能与其体积和细胞膜表面黏附分子的表达及存在与类似于失巢凋亡的调节有关，具体原因有待于进一步研究。
细胞来源的鉴定通常采用16S rRNA、12S rRNA和Cyt b等基因片段，其中16S rRNA基因属于进化缓慢的保守序列，因此笔者选择16S rRNA基因进行鉴定，序列分析结果与宽口裂腹鱼基因序列一致性达99.91%，证明该细胞系来自于宽口裂腹鱼。
3.2 盐碱度对宽口裂腹鱼尾鳍细胞增殖的影响
水体中盐碱度水平对鱼类的存活有显著的影响，盐碱度过高或过低都会使鱼类的存活率显著的降低[18-19]。在尼罗罗非鱼盐碱度的耐受性研究中，盐度为20时仅少数个体能存活到96 h，碱度为12 g/L(以NaHCO3计)时，96 h全部死亡[20]；
对小黄鱼进行盐度胁迫试验时，盐度为5.0～22.1时，小黄鱼10 d内存活率极高，随着盐度降低或者升高，小黄鱼的存活率持续下降[21]。宽口裂腹鱼是塔里木河水系的土著鱼类，1958年博斯腾湖测定的pH为 8.1～8.4，矿化度为0.39 g/L，1981年博斯腾湖测定的pH为8.5～8.7，矿化度为180 g/L[36]，2013年塔里木河流域Cl-和Na+浓度明显增大[37]，2021年塔里木河流域pH为7.58～8.32，Cl-/(Cl-+HCO3-)的平均比率为0.23，Na+/(Na++Ca2+)的平均比率为0.39[38]。盐碱度无规律的变化是导致物种资源衰竭的原因之一，盐碱度对塔里木河叶尔羌高原鳅(Triplophysayarkandensis)影响的结果显示，其从原来的趋淡水性转变为趋咸水性[39]。本试验中，1‰、2‰、4‰、6‰、8‰ NaCl依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率上升，8‰、10‰ NaCl依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率下降，8‰ NaCl时宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率最高；
2、3、4、5、6、7 g/L NaHCO3依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率上升，7、8、10 g/L NaHCO3依次使宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率下降，7 g/L NaHCO3时宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率最高。本试验结果表明，盐碱度过高或过低均会导致宽口裂腹鱼尾鳍细胞的存活率降低。
笔者初步建立宽口裂腹鱼尾鳍细胞系，尾鳍细胞传至45代。呈悬浮生长，最适培养液为DME/F12，最适胎牛血清体积分数为20%，最适温度为25 ℃。在最适条件下，第10代宽口裂腹鱼尾鳍细胞系细胞系细胞的群体倍增时间为24.94 h，细胞分裂旺盛，呈“S”型。第6代细胞液氮冷冻保存180 d后复苏，经台盼蓝染色计数，宽口裂腹鱼尾鳍细胞系有(88.72±0.99)%的细胞具有活性；
复苏后增殖速度快，可正常传代。宽口裂腹鱼尾鳍细胞系第10代细胞线粒体16S rRNA序列分析结果与宽口裂腹鱼基因序列一致性为99.91%，从分子水平证明该尾鳍细胞系来自宽口裂腹鱼。宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率随NaCl质量浓度增加呈现先升后降趋势，8‰NaCl时宽口裂腹鱼尾鳍细胞系细胞相对增殖率最高；
宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率随NaHCO3质量浓度增加呈先升后降趋势，7 g/L相对增殖率时宽口裂腹鱼尾鳍细胞系相对增殖率最高。