祁 军 刘 誉 李浩辰 天津国际旅行卫生保健中心（天津，300456）
刘 寅（通信作者） 南开大学医学院（天津，300074）
病原体检测一直是疾病防控当中最重要的一个环节。
准确的检测方法能够为有效地阻止传染性疾病扩散提供重要的依据。
常见的病原体检测方法可以分为形态学检测、生理生化检测、免疫学检测以及核酸检测等。
这其中核酸检测方法呈现出独特的优势。
核酸检测方法基于分子生物学技术，依靠核酸分子双链碱基互补配对原则，实现对目标核酸的检测。
传统的核酸检测方法大致分为两类［1-5］：第一类是基于核酸特异性的核酸分子杂交技术，即具有同源性的核酸单链在一定条件下会依据碱基互补配对原则形成双链。
常见的技术有Southern DNA印迹杂交，以及核酸生物芯片技术等，这些方法在酶切图谱制作、基因克隆筛选、基因突变检测等科研领域应用广泛。
第二类是通过在体外模仿体内DNA 复制过程，实现对于某段目标序列的扩增。
目前使用的绝大多数核酸检测方法均可以归于这一类别。如聚合酶链式反应技术（PCR）、实时荧光定量PCR（Real Time PCR），以及各种核酸等温扩增技术（Isothermal Nucleic Acid Testing，INAT）等［6-8］。但是，无论是PCR 方法还是实时荧光PCR 方法，都需要进行变温循环，因此上述方法对温度控制设备的严重依赖，限制了其在检测中的广泛应用，不利于向基层推广，特别是在应对大量样品时，将极大延长检测时间并且降低样本生物活性。
为了克服PCR 检测技术的缺陷，近年来，核酸等温检测技术不断出现，这些技术在临床检测中发挥了重要作用的同时显示出了极大的优势，逐渐成为可以替代PCR 技术的新型核酸检测技术。当下的核酸等温检测技术主要是核酸等温扩增技术，该技术不需要变性、退火和延伸等热循环的步骤，因此核酸等温扩增检测技术对仪器的要求极低，仅需要一个恒温水浴锅就可以实现反应［9-11］。
与PCR 方法类似，核酸等温扩增技术具有敏感性高、特异性强等优点。
目前常用的核酸等温扩增技术有重组酶聚合酶扩增技术 （Recombinase polymerase amplification，RPA）、 环介导等温扩增技术 （Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、 滚 环 扩 增 技 术（Rolling circle amplification，RCA）、切刻酶扩增技术（Nicking endonuclease amplification reaction，NEAR）等［12-14］。核酸等温扩增技术由于降低了对检测设备的依赖，因此发展迅速。
但是也存在不足，例如假阳性比例高，引物设计复杂，体系复杂，成本较高等［15，16］。鉴于此，非扩增核酸等温检测技术应运而生。
非扩增核酸等温检测技术并不依赖于目的片段的数量增加而进行信号放大，而是依靠模板与分子信标探针结合后切断探针产生检测信号。
例如快速等温检测技术 （Rapid isothermal detection assay，RIDA）和基于核酸内切酶活性的分子信标检测技术（Dependence Endonuclease Molecular Beacon Assay，DEMBA）［17，18］。
DEMBA 在具备RIDA 优势的同时，更适合于单链RNA 的检测。
首先，内切酶识别的切点位置完全在探针双链上，不受检测目标序列是否具有核酸内切酶识别位点的限制；
其次，单链RNA模板和探针杂交，改变探针二级结构，并不参与酶切反应；
第三，核酸内切酶种类繁多，为针对不同病原体检测方法的开发提供了便利；
第四，检测速度快，在检测荧光信号的情况下，5 分钟之内即可得到检测信号。
是一种非常适合于高突变率单链RNA病毒的快速检测技术。
该技术的主要不足在于需要进行荧光信号检测，无法实现现场检测和自主检测。
为了进一步推广该技术， 本研究中我们通过DEMBA 结合胶体金检测试纸， 实现了体温条件下的无设备参与检测，与传统方法相比，流程进一步简化。
1.1 实验材料
本实验使用到的主要实验试剂，见表1。
表1 实验试剂
1.2 探针设计
根据中国疾病与预防控制中心的推荐，我们针对新型冠状肺炎病毒的ORF lab 和N 基因作为目标序列，开展DEMBA 检测。
目标序列的长度在35-45 nt 之间。目标序列的特异性通过在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）网页上BLAST 确定。
最后使用NUPACK 软件对探针的二级结构、探针和目标序列形成的复合物的二级结构进行评估。
我们设计了DEMBA 探针P1（见表2），检测目标序列依次命名为Templte 1。
为了进一步评估探针的特异性，我们针对Templte 1 设计了具有点突变位点的目标序列，见表2。
其中1MT 和3MT 是目标序列Templte 1对应的具有突变碱基的目的序列1MT，在突变碱基点下面划线。
以1MT 的序列合成了ssDNA 和ssRNA，分别命名为1MT-RNA、1MT-DNA。上述涉及的探针和目标序列都由上海生工生物公司合成。
表2 探针和目标基因的序列
1.3 DEMBA 检测
DEMBA 检测体系构成如下：反应体系的总体积是25 μL，其中包括ddH2O、NEBuffer 2.1[5 mM NaCl，1 mM Tris-HCl，1 mM MgCl2，10 μg/mL BSA（pH7.9，25 ℃）]，BsrDⅠ的反应终浓度为100 units/mL，探针终浓度为0.5 μM。
我们优化后的通用型DEMBA 反应检测条件是60 ℃孵育40 min，P3 的反应混合液61 ℃孵育10 min，然后80 ℃5 min 灭活内切酶。
为了系统地评估DEMBA 检测体系的作用，我们设置了四个对照组。
通用型DEMBA 反应体系及对照组的反应体系见表3。
结果使用电压8 V/cm 评估DEMBA 检测结果。
表3 DEMBA 电泳反应体系
1.4 特异性和灵敏度的评估
我们设计了具有碱基突变DNA 序列1MTDNA 和RNA 序列1MT-RNA，作为参考样品并对其稀释后进行荧光DEMBA 检测。另外，我们将浓度较高的大肠杆菌全基因组DNA 作为背景干扰， 以评估针对DNA 检测目标物的特异性。
同时我们以等体积的随机RNA 序列替换目标序列RNA， 以评估针对RNA 检测目标物的特异性。
为确定DEMBA 的灵敏度， 我们将模板进行梯度稀释至102copies/μL， 使用梯度稀释液进行灵敏度评估。
1.5 胶体金检测
我们将DEMBA 探针两侧分别标记上FAM 基团和Biotin 基团。
同时将胶体金的金胶垫上浸透金颗粒标记的生物素抗体，T 线上包被FAM 基团抗体，C 线上报备抗生物素抗体的二抗。其基本原理如1 所示。
DEMBA 检测液从热循环仪中取出， 利用涡旋混合仪轻微离心。
取2 mL 的EP 管，加入70 μL 试纸条的配套缓冲液。
而后取8 μL 的稀释后的反应产物混合液滴加在试纸条的样品垫上；
将滴加了反应液的试纸条的那端放入含缓冲液的EP 管中。
在15 min 内观察并拍照记录试纸条的结果。
2.1 探针的二级结构评估
本文设计了两条体温DEMBA 探针， 它们只有酶切位点不同。
这两条探针及探针与目标序列的复合物的二级结构预测结果， 由NUPACK 软件生成。如图3.2 所示，评估结果预测表明没有目标序列时，探针在37 ℃下均能维持稳定的双发卡二级结构，没有呈现内切酶位点， 探针不会被酶切割， 如图2-a所示。当探针和目标序列的浓度比例为1∶1 时，预测产物只有目标复合物一种，预测产率100%。
这表明探针和目标序列易于结合形成复合物，探针具有较强的特异性。
复合物的自由能都比较低，即软件预测复合物的结构相对稳定。
同时复合物自由能低于探针的自由能， 这显示探针在被内切酶切割后，其他探针在自由能驱动下倾向于和目标序列形成更稳定的Y 字形结构，如图2-b 所示。
图2 探针模拟结构分析结果
2.2 电泳分析
电泳结果如图3 所示。
单独探针的电泳条带位置在20 bp DNA ladder 的位置附近 （lane 1 和6，band B），目标序列的电泳条带位置低于20 bp DNA ladder（lane 2 和7，band E），这与探针和目标序列的实际分子大小相当。
探针和目标序列的混合液中，形成新的复合物， 位置在40～60 bp DNA ladder 之间（lane3 和8，band A）。
表明反应体系下探针和目标序列结合形成具有两条双链Y 字形复合物。
在复合物中加入限制性内切酶Bpu 10I 后， 电泳结果中出现了一条新的条带C（lane4 和9，band D），它低于电泳条带的位置却高于目标序列条带的位置。
这是内切酶切割探针后产生的新碎片。
在没有目标序列时，探针酶切产物的电泳条带和纯探针电泳条带位置相同（lane5 和10，band C），表示当目标序列不存在时，探针会维持双发卡结构不会被酶切割。
图3 DEMBA 检测电泳分析结果
2.3 DEMBA 结合胶体金试纸检测
我 们 使 用 目 标 序 列10、102、103、104copies/μL的梯度稀释液作为反应液进行反应， 将DEMBA 反应后的反应液与缓冲液混合滴加到试纸条，将试纸置于室温下15 分钟。
实验结果如图4 所示， 表明102、103、104copies/μL 的标准稀释液能够检测出阳性反应。
表明在我们使用DEMBA 检测技术开发的联合胶体金RNA 恒温非扩增检测法能够获得较好的检测结果。
特异性检测中，我们发现即使单碱基突变的模板也呈现阴性结果。
证明该技术有较高的特异性。
图4 联合胶体金RNA 非扩增等温检测技术
在摸索DEMBA 探针通用骨架时， 我们尝试使用Aor13HI （Takara）、BstPI （Takara）、BstBI（NEB）、BsrDI（NEB）等限制性内切酶的序列。
但是经过实验发现，如果以识别序列两端对称的酶，作为DEMBA的骨架结构，则在没有目标序列时，探针可能会出现单发卡结构。因此我们推荐，在设计DEMBA 探针时， 使用识别序列两端不对称的酶作为DEMBA 的骨架结构。
如果使用识别序列两端对称的酶设计DEMBA 探针，则部分DEMBA 探针由于稳定序列部分的结合力弱于由内切酶位点自身相互识别结合的力， 在没有目标序列时探针形成了单发卡结构。但是该结构会呈现内切酶位点，让探针在没有目标序列时被内切酶切割，造成假阳性结果。
如果要避免该情况，则需要延长DEMBA 探针的稳定序列，此时探针长度加长，增加研发成本，同时容易影响探针的二级结构。
而两端识别序列具有非对称性的酶， 如BsrDI作为通用DEMBA 骨架时，通过适当调整稳定序列，可以避免这种情况。
同时，即使探针形成二聚体结构， 内切酶位点的部分序列会被DEMBA 探针的其他部分封闭，避免被酶识别，也避免假阳性结果。
因此在进行通用DEMBA 骨架设计时， 我们建议以两端识别序列具有非对称性的内切酶作为骨架的一部分。
我们在设计过程中， 发现DEMBA 反应混合液中内切酶的量远远多于需要切割的探针数量，但是酶消化的目标复合物较少。
当探针两端不含保护碱基时，电泳结果显示，探针和目标序列产生了较多的复合物，但是在复合物反应体系中加入内切酶消化的结果却不理想。
我们推测在反应过程中，一方面可能是由于酶切位点序列结合时受到的阻力较大，酶切位点形成的双链结构不稳定，所以酶的识别效果差。
另一方面可能是，在酶切位点序列两端没有足够的位置让内切酶结合。
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