赵丽 原大江
(山西医科大学 1麻醉学系，山西 太原 030001；
2第二医院重症医学科)
急性心肌梗死病理过程中，梗死冠脉再通可以限制梗死范围，改善心肌收缩功能，然而缺血心肌再灌注后会导致梗死心肌损伤程度进一步加重，降低治疗的成功率，称为缺血/再灌注(I/R)损伤〔1〕。有研究表明，自噬在心肌I/R的不同阶段发挥不同的作用〔2〕。当心肌细胞处于缺血状态时，细胞的自噬水平会适度激活，通过循环利用功能失调的胞质成分弥补线粒体损伤从而保护心肌细胞〔3〕。在再灌注过程中，过度氧化应激导致Beclin-1过表达，细胞自噬被过度激活，促进细胞重要成分过度降解和自我消化，加重心肌细胞的损伤〔4，5〕。
研究证实，当心肌缺血时心脏感觉神经在心肌组织间释放降钙素基因相关肽(CGRP)增加〔6〕，CGRP可激活线粒体ATP敏感性钾通道(KATP)通道(mitoKATP通道)，稳定线粒膜电位，保护I/R心肌细胞〔7〕。研究发现，CGRP预处理与自噬密切相关〔8，9〕。本研究旨在探讨CGRP的心脏保护作用是否与其抑制过度自噬有关，并探讨其潜在作用机制。
1.1主要试剂和仪器 H9c2大鼠心肌细胞株(武汉普赛诺公司)。CGRP、CGRP8～37(Sigma公司，美国旧金山)；
无菌磷酸盐缓冲液(PBS)(批号PYG0021，BOSTER公司)、高糖改良杜氏伊格尔培养基(DMEM,批号PYG0073，BOSTER公司)；
1%青/链霉素双抗(批号P1400，索莱宝公司)；
胎牛血清(批号11011-8611，四季青公司)；
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(批号C1086，碧云天公司)；
p-蛋白激酶B(AKT)，AKT，p-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和mTOR(Abcam公司)〕；
C3B重组兔单克隆抗体(批号3868T，CST公司)；
Beclin-1兔多克隆抗体(批号11306-1-AP，proteintech公司)；
Cytochrome C多克隆抗体(批号SA00001-2，proteintech公司)；
HRP-标记的山羊抗兔IgG(批号SA00001-2，proteintech公司)；
线粒体膜电位检测试剂盒 JC-1(批号C2006，碧云天公司)。超净工作台(世安，中国)；
CO2细胞恒温培养箱(型号：800WJ3423，Thermo Forna美国)；
PH 仪(批号PHSJ-SF，上海精科有限公司，中国上海)；
奥林巴斯OlympusDP73 荧光显微镜(TKO光学仪器股份有限公司，日本)。
1.2方法
1.2.1H9c2细胞培养及建立H/R模型 常规培养H9c2心肌细胞。隔2 d换液，培养3～4 d按照1∶4比例传代，细胞常规培养至亚融合(肉眼估计>80%)，选择生长状态良好的细胞进行H/R处理。自制H/R盒，使用前通氮气除去盒子中的氧气，配制缺氧液，使用前通氮气饱和3 h；
配制复氧液，使用前通氧气饱和30 min。缺氧培养：H9c2心肌细胞中加缺氧液于培养3 h，期间持续通入氮气(1 L/min)至氧分压为25 mmHg；
复氧培养：加复氧液，正常培养2 h。
1.2.2实验分组 空白对照组：正常培养；
H/R组：进行H/R处理；
参照文献〔8〕，1×10-1mol/L CGRP对H/R后心肌细胞有比较显著的保护作用，1×10-7mol/L CGRP8～37对CGRP的心肌保护有明显的拮抗作用，本实验选择该浓度进行实验。CGRP组：加入 CGRP 1×10-8mol/L作用20 min，缺氧3 h，复氧2 h；
CGRP8～37组：于H/R前30 min加入1×10-7mol/L CGRP8～37作用10 min，加入CGRP作用20 min。
1.2.3台盼蓝染色检测各组H9c2心肌细胞存活率 各组实验完成后，收集并重悬细胞，加入台盼蓝染液，吸取少量经过染色的细胞，用血细胞计数板计数，细胞存活率=(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数×100%。
1.2.4TUNEL法检测H9c2心肌细胞凋亡 实验完成后，先利用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液染细胞核，方便计数每个视野下的细胞总数，然后根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，每孔随机选择5个视野，荧光显微镜下观察计算细胞凋亡率=阳性细胞/细胞总数×100%。
1.2.5检测H9c2心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性 收集各组心肌细胞培养液，4℃离心取上清，根据LDH检测试剂盒操作流程，绘制标准曲线，计算各组LDH活性。
1.2.6JC-I检测H9c2心肌细胞线粒体膜电变化 根据试剂盒操作流程标记线粒体，荧光显微镜下观察记录。
ImageJ 软件计算平均荧光强度，计算红/绿荧光强度比值。
1.2.7Western印迹检测Beclin-1、微管相关蛋白1轻链(LC)3、p-AKT，AKT，p-mTOR和mTOR表达量 加裂解液，冰上裂解，离心，取上清，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白质浓度，将样品中加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(5×)混匀，沸水浴，使蛋白充分变性。制备SDS-PAGE，上样，电泳，然后转膜。膜用TBST漂洗，封闭液封闭3 h，加入一抗(LC3B 1∶1 000；
Beclin1 1∶1 000；
p-AKT，AKT，p-mTOR和mTOR 1∶5 000；
β-Actin 1∶2 000)，4℃摇床孵育过夜。膜漂洗后加入二抗(1∶2 000)，室温摇床孵育2 h，将条带放于曝光仪器平板上，将AB显色液滴加到条带上，曝光显色，应用 Quantity One 软件进行图像量化，分析蛋白的相对表达量。
1.3统计学方法 采用SPSS23.0软件进行方差分析、LSD-t检验。
2.1不同处理方法对H9c2心肌细胞存活率的影响 与空白组比较，H/R组H9c2心肌细胞存活率明显下降(P<0.01)；
与H/R组相比，CGRP组H9c2心肌细胞存活率明显升高(P<0.01)；
CGRP8～37可部分逆转CGRP的作用，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
2.2不同处理方法对H9c2心肌细胞凋亡率的影响 蓝色荧光为视野下的所有有核细胞。绿色荧光为TUNEL染色后的阳性细胞，提示细胞凋亡。见图1。与空白组比较，H/R组H9c2心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.01)；
与H/R组比较，CGRP组H9c2心肌细胞凋亡率明显下降(P<0.01)；
与CGRP组比较，CGRP8～37组心肌细胞凋亡率明显上升(P<0.01)。见表1。
2.3不同处理方法对H9c2心肌细胞LDH活性的影响 与空白组比较，H/R后H9C2心肌细胞LDH活性明显升高(P<0.01)。加入CGRP预处理后细胞LDH活性明显降低(P<0.01)。与CGRP组比较，CGRP8～37组LDH活性明显升高(P<0.01)。见表1。
2.4不同处理方法对H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响 与空白组比较，H/R组红/绿荧光比值明显下降，线粒体膜电位去极化(P<0.01)；
与H/R组相比，CGRP组红/绿荧光比值明显升高，线粒体膜电位超极化(P<0.01)；
CGRP8～37组可逆转CGRP组的作用，差异有统计学意义(P<0.01)。表1、见图2。
2.5不同处理方法对H9c2心肌细胞自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的影响 与空白组对比，H/R组的H9c2心肌细胞自噬标志蛋白Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显上升(P<0.01)。与H/R组比较，CGRP组的H9c2心肌细胞Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显下降(P<0.01)，CGRP8～37组可拮抗CGRP的作用，差异有统计学意义(P<0.01)。
见表1、图3。
2.6不同处理方法对H9c2心肌细胞AKT/mTOR通路蛋白p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR表达量的影响 与空白组对比，H/R组H9c2心肌细胞p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值明显下降(P<0.01)。与H/R组比较，CGRP组p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值明显升高(P<0.01)。CGRP8～37组可拮抗CGRP的作用，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4、表2。
表1 各组心肌细胞凋亡率、凋亡率、LDH红绿荧光自噬蛋白表达量的比较
图1 各组H9c2心肌细胞(TUNEL染色，×200)
红色荧光线粒体膜电位超极化，绿色荧光线粒体膜电位去极化图2 各组H9c2心肌细胞荧光显微镜下线粒体膜电位(×400)
图3 Western印迹检测各组H9c2心肌细胞Beclin-1和 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白的表达
图4 Western印迹检测各组H9c2心肌细胞Akt/mTOR 信号蛋白的表达
表2 CGRP对Akt/mTOR信号通路的影响
本研究表明，LDH的释放量可反映细胞的损伤程度。为进一步测定细胞的损伤程度，检测了细胞外液中LDH的浓度。结果发现，H/R后心肌细胞培养液中LDH浓度升高，CGRP预处理后LDH浓度下降，CGRP8～37可逆转CGRP的作用，本实验结果与之前的研究〔7〕结果一致，CGRP可减轻心肌细胞H/R损伤。
细胞凋亡存在于心肌细胞I/R损伤过程中。线粒体膜电位的下降提示细胞处于凋亡早期。本研究结果与先前CGRP保护I/R心肌细胞的报道〔10〕一致。有研究认为，在I/R心肌细胞中自噬具有调节作用，但是CGRP通过影响自噬水平减轻I/R心肌细胞损伤的报道很少。
细胞生理状态下，自噬维持在较低的基础水平，通过降解功能受损的蛋白质和细胞器，保持细胞内环境稳定〔9〕。细胞在营养物质匮乏、能量耗尽等应激情况下会诱导自噬发生，自噬对细胞成分降解和再循环，成为细胞暂时的营养物质来源〔11，12〕。心肌细胞I/R时会诱导过度自噬，过多的自噬小体与溶酶体结合，吞噬降解正常的细胞器及蛋白质，加重心肌细胞损伤〔13〕。LC3是自噬体形成的关键蛋白。当自噬激活时，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇共价结合后形成LC3-Ⅱ，定位于自噬体膜。因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬水平〔14〕。Beclin-1是一种Bcl-2相互作用蛋白，也是一种重要的自噬启动蛋白，可与其他自噬调节蛋白结合形成蛋白复合物，调控自噬水平〔15〕。据报道，敲除Beclin-1基因可降低心肌细胞再灌注时诱导的过度自噬，改善心脏损伤〔16〕。本研究结果与先前报告一致〔17〕，同时CGRP可降低H/R心肌细胞 LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白质的表达，上述作用可被CGRP8～37抑制，由此可见，CGRP可能通过抑制H/R诱导的过度自噬从而保护H/R心肌细胞。
磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT/mTOR途径在许多细胞过程和细胞功能中起着不可或缺的作用，包括肿瘤的增殖、迁移、黏附、存活和分子改变〔18，19〕。研究表明，mTOR是细胞生长的核心调节剂，它可以负性调控自噬活性〔20～22〕。越来越多的证据证明，AKT激活在I/R或H/R后的心脏保护中起着至关重要的作用〔23～25〕。本实验结果可见，Akt/mTOR信号通路可能参与CGRP调控自噬。
综上，在体外模型中证明，CGRP可能部分通过激活AKT/mTOR通路抑制过度自噬，从而保护H/R心肌细胞。
CGRP和自噬之间的相互作用为预防I/R诱导的心肌细胞凋亡和损伤提供了新的策略。然而，需要使用自噬激动剂和自噬抑制剂来更深入的研究评估CGRP的心脏保护作用，并且进一步阐明确切的分子机制。
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