陈思思，王俊，郑杭生
(1.浙江省湖州市第三人民医院药剂科，湖州 313000；
2.浙江中医药大学药学院，杭州 310000)
三七总皂苷(Panaxnotoginsengsaponins，PNS)是中药三七的主要有效成分，包含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1等单体成分[1-2]，PNS具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和降血脂等作用[3-5]。临床上广泛用于治疗心脑血管疾病(包括急性脑梗死、阿尔茨海默病、急性心肌梗死、高脂血症等)，骨科疾病(包括膝骨关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎等)和慢性阻塞性肺疾病等[6]。
目前，PNS在临床的应用多为注射剂与口服制剂。因注射剂安全性低及患者自给药不便，口服制剂生物利用度不高、胃肠道的刺激性而限制其使用。经皮给药具有避免首关效应、安全性好、血药浓度更平稳等优点，尤其适用于局部治疗给药(如软组织损伤、骨折等)。前期，本课题组通过皮肤外用PNS经皮给药制剂对大鼠急性软组织损伤具有良好的治疗作用[7]，本研究将建立超高效液相色谱法(ultra high performance liquid chromatography，UPLC)测定外用三七总皂苷传递体喷雾剂后大鼠皮肤中4种皂苷成分(三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1)的含量，为后期进行制剂的作用机制研究提供科学高效的检测方法。
1.1仪器 超高效液相色谱仪：Acquity UPLC(美国Waters公司，二元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器)；
MSE3.6P-0CE-DM型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，感量：0.001 mg)；
低速离心机(上海安亭科学仪器公司)；
R-502旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；
Q501恒温水浴锅(巩义市英峪高科仪器厂)；
HOMOEX-25高压膜挤出器(上海赫默仕机电科技有限公司)；
聚碳酸酯径迹蚀刻膜(型号：0.05，0.1 μm，英国Whatman公司)；
XL2000超声破碎仪(美国Misonix公司)；
Nano-ZS90激光粒径仪(英国Malvern公司)；
喷雾瓶(杭州宾达包装材料有限公司)。
1.2试药 三七总皂苷(陕西森朗生物化工有限公司，批号：TB20201210，含量>95%)；
对照品：三七皂苷R1(批号：110745-201921，含量以90.4%计)、人参皂苷Rg1(批号：110703-202034，含量以94.0%计)、人参皂苷Re(批号：110754-202028，含量以93.9%计)、人参皂苷Rb1(批号：110704-202028，含量以93.1%计)，均由中国食品药品检定研究院提供；
大豆磷脂(注射级，上海太伟药业股份有限公司，批号：202007022，含量≥70%)；
高纯胆固醇(注射级，艾伟拓上海医药科技有限公司，批号：B90867)；
柠檬烯(批号：20200916，含量≥95%)、柠檬醛(批号：20201009，含量≥96%)、维生素E(批号：20201118，含量≥98%)，由江西源上草香料有限公司提供；
乙腈为色谱纯(美国Honeywell公司)；
甲醇、丙酮为分析纯(天津永大化学试剂有限公司)；
水为超纯水；
其余试剂均为分析纯。
1.3动物 清洁级雄性SD大鼠，体质量(180±20) g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0002。饲养于普通级环境，室温15～30 ℃，相对湿度30%～75%，单笼普通饲料喂养，自由饮用纯净水。
2.1对照品溶液的制备 分别精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品适量，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶液定容，摇匀，得混合对照品储备液，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1浓度分别为0.104，0.426，0.058，0.452 mg·mL-1。
2.2色谱条件 色谱柱：Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；
流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～8 min，19% → 25% A；
8～9 min，25% → 42% A；
9～12 min，42%→55% A；
体积流速：0.5 mL·min-1；
检测波长：203 nm；
进样量：1 μL，柱温：30 ℃。
2.3三七总皂苷传递体(脂质体)喷雾剂的制备 按前期优化的处方工艺制备三七总皂苷传递体[7]：称取三七总皂苷100 mg、高纯胆固醇15 mg、大豆磷脂120 mg、维生素E 2 mg、中药挥发油(柠檬烯：柠檬醛= 4：1)80 mg，溶于甲醇：二氯甲烷(3：4)混合溶剂35 mL中，转移至500 mL茄形瓶中，在避光、45 ℃、50 r·min-1下减压旋转蒸发去除溶剂，得到干膜，继续旋转蒸发2 h以确保有机溶剂除尽，加入10 mL水化液[磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为5.0，相对离子浓度为1/10]，振摇至水化完全，放置过夜后进行超声破碎处理(温度为25 ℃，功率为19 W，时间为1 min，开5 s，关5 s)，并将传递体混悬液在40 ℃水浴、氮气压条件下依次挤压通过100 nm与50 nm孔径的聚碳酸酯径迹蚀刻膜(挤出压力分别为0.25，0.49 MPa)，即得三七总皂苷传递体，装入喷雾瓶中得喷雾剂。三七总皂苷脂质体喷雾剂的制备是在上述处方工艺基础上去除中药挥发油成分，其余制备工艺相同。
2.4给药 取健康SD大鼠(雄性)，乙醚麻醉后固定于鼠板上，用剃毛器小心剔除腹部毛发，并用弯剪进行修理，在修理后的腹部皮肤上给予三七总皂苷传递体喷雾剂(三七总皂苷含量为5 mg)0.5 mL，给药面积为2 cm2。
2.5皮肤样品的制备与处理
2.5.1空白皮肤的制备 取正常大鼠，用过量乙醚麻醉致死，固定于鼠板上，用剃毛器和弯剪去除大鼠胸骨至腹部的毛发，取下腹部皮肤并去除皮下组织(确保不破坏皮肤角质层)，用0.9%氯化钠溶液进行清洗，吸干水分，用锡箔纸包裹后置于-70 ℃冰箱保存，备用。
2.5.2空白皮肤样品的处理 参照文献[8]方法。取“2.5.1”项下大鼠离体皮肤，室温解冻，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，加入0.9%氯化钠溶液200 μL，充分研磨，得皮肤匀浆：将提取溶剂(丙酮：甲醇 = 3：1)3 mL加入皮肤匀浆中，涡旋2 min，于2000 r·min-1离心15 min(离心半径25 cm，相对离心力为1119×g)后，取上清液，重复提取2次，合并提取液至具塞塑料离心管中，60 ℃下氮气流吹干，残留物用甲醇50 μL溶解，离心后取上清液1 μL，按“2.2”项下色谱条件进样分析。
2.5.3用药后皮肤样品的处理 按“2.4”项下进行皮肤给药，一段时间后用过量乙醚麻醉大鼠致死，按“2.5.1”项下方法取下给药部位皮肤，用0.9%氯化钠溶液冲洗皮肤表面未被吸收的药物，吸干多余水分，按“2.5.2”项下进行皮肤样品处理后按“2.2”项下色谱条件进样分析。
2.6方法学考察
2.6.1标准曲线的绘制 取“2.5.1”项下空白皮肤，室温解冻，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，分别加入“2.1”项下混合对照品储备液2，4，10，25，50，75，100，200 μL，按“2.5.2”项下进行皮肤样品处理，按“2.2”项色谱条件进样分析。以峰面积(Y)对含量(X)进行线性回归，结果见表1，由此可知各成分在各自范围内线性关系良好。
表1 4种成分线性关系
2.6.2专属性考察 取“2.5”项下空白皮肤、给药后的皮肤及空白皮肤加对照品溶液，按“2.5”项下进行处理，按“2.2”项下色谱条件进样分析，结果见图1。由图可见，该方法专属性良好。
A.空白皮肤；
B.空白皮肤+混合对照品溶液；
C.给药后的皮肤；
1.三七皂苷R1；
2.人参皂苷Rg1；
3.人参皂苷Re；
4.人参皂苷Rb1。
2.6.3精密度与准确度实验 取“2.5.1”项下空白皮肤，室温解冻，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，加入低、中、高3个浓度的混合对照品溶液(其中三七皂苷R1含量依次为0.42，5.20，20.80 μg；
人参皂苷Rg1含量依次为1.70，21.30，85.20 μg；
人参皂苷Re含量依次为0.23，2.90，11.60 μg；
人参皂苷Rb1含量依次为1.81，22.6，90.40 μg)，按“2.5.2”项下进行处理，于1 d内连续测定6次，得日内精密度；
于连续6 d内各测1次，得日间精密度；
同时测定准确度，结果见表2。结果表明，该方法具有良好的精密度与准确度。
表2 4种成分精密度与准确度实验结果
2.6.4提取回收率实验 取“2.5.1”项下空白皮肤，室温解冻，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，先加入低、中、高3个浓度的混合对照品溶液，按“2.5.2”项下进行处理，重复3次；
另取1 cm2大小空白皮肤，按“2.5.2”项下方法操作，在加入提取溶剂的时，加入对应浓度对照品溶液，其他步骤不变，重复3次。测得提取回收率为90.31%～102.70%，符合生物样本含量测定要求。
2.6.5稳定性实验 取空白皮肤，室温解冻，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，加入低、中、高3个浓度的混合对照品溶液，按“2.5.2”项下进行处理，制成质控样品，测得的浓度定为初始参比值，分别将上述样品于室温放置24 h、-20 ℃反复冻融3次、-20 ℃冷冻保存30 d条件下平行测定3份样品，将所得浓度与初始值相比，考察样品在室温、冻融循环和冷冻条件下的稳定性，结果见表3。结果表明，样品溶液稳定性良好。
表3 4种成分稳定性实验结果
2.7皮肤中药物滞留含量测定 按“2.3”项下方法制备三七总皂苷传递体喷雾剂和三七总皂苷脂质体喷雾剂，按“2.4”项下给药。12 h后按“2.5.3”项下方法取下含药皮肤，分为两等份，其中一份用胶带黏贴角质层侧皮肤，重复20次，得去角质层皮肤，用于测定角质层下皮肤药物滞留量；
另一份不做处理，用于测定全皮药物滞留量，两者差值即为角质层中的药物滞留量。按“2.5.3”项下方法处理，进样分析，结果见表4。结果表明，两种不同制剂应用12 h后，其中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re在全皮与角质层下皮肤中的滞留量均为三七总皂苷脂质体喷雾剂>三七总皂苷传递体喷雾剂，而人参皂苷Rb1则恰好相反。此外，通过计算全皮与角质层下皮肤中药物滞留量的差值可以看出三七总皂苷脂质体喷雾剂中各成分在角质层的滞留量大于三七总皂苷传递体喷雾剂。
表4 4种成分皮肤滞留量测定结果
对于皮肤样品前处理方式的选择：对比化学方式(强腐蚀性的高氯酸)与物理方式(手动研磨成匀浆)后发现，虽然化学方式能较大的节约人力与时间，但相比物理方式，该方法的药物提取回收率明显降低，说明化学方式可能对药物稳定性影响较大，故本实验采用物理方式进行皮肤样品前处理。对于柱温与体积流量的选择：对比25，30，35 ℃ 3种柱温及0.4，0.5，0.6 mL·min-13种体积流量，发现在30 ℃柱温和0.5 mL·min-1体积流量条件下人参皂苷Rg1和人参皂苷Re 2个相邻成分以及人参皂苷Rb1与杂质峰的分离度较好。
本课题组前期采用高效液相色谱法(HPLC)进行大鼠皮肤中三七皂苷R1和人参皂苷Rb1的含量测定[8]，采用乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，但该分析方法存在耗时久(分析时间> 60 min)、流动相消耗大等问题。同时，本课题组发现采用HPLC法同时测定多种皂苷成分时并不能将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re这两个相邻的色谱峰完全分离。通过本研究所建立的UPLC法能够同时测定大鼠皮肤中4种皂苷成分的含量，该方法相比HPLC法具有更好的分离度与灵敏度，且分析时间大大缩短[9-11]，能够在保证准确性的同时有效提高检测效率。
此外，本研究利用UPLC法对2种不同制剂(三七总皂苷传递体喷雾剂与三七总皂苷脂质体喷雾剂)中4种皂苷成分的皮肤滞留特性进行初步探究。通过比较2种制剂中4种皂苷成分在大鼠皮肤不同部位中的滞留量，发现三七总皂苷脂质体喷雾剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re在大鼠皮肤中(尤其是角质层中)的滞留量较大，这一结果符合这两种载体的皮肤转运机制(即传递体由于其自身良好的变形性能，通过诱导皮肤屏障中水性通道扩张，再加上利用皮肤水化梯度形成的渗透力使其能够完整的穿过皮肤屏障；
而脂质体仅仅依靠单纯的膜间转运形式促使药物透过皮肤，这就使得大量药物难以透过皮肤角质层而滞留于其中；
而人参皂苷Rb1成分在大鼠皮肤中的滞留情况则与上述3种成分相反，这一点与本课题组的部分前期研究结果相一致[8]，推测可能是由于该成分本身结构的特殊性所造成，具体原因有待进一步的研究。
本研究建立检测方法经济、高效、准确，可为后期进行三七总皂苷相关制剂皮肤渗透、滞留机制的研究奠定良好基础。
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