鲁瑞刚，陆进舟，朱佳莲，周 牵，陆筑凤，李加友
（1.浙江嘉善黄酒股份有限公司，浙江 嘉兴 314100；
2.嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001）
细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是由醋酸菌属（Acetobacter）、根瘤菌属（Rhizobium）、土壤杆菌属（Agrobacterium）和八叠球菌属（Sarcina）等微生物在不同条件下合成的纤维素统称[1]。细菌纤维素不含木质素、果胶和半纤维素等伴生产物，具有高结晶度和高聚合度，拥有纳米级的超精细网状结构（因此又称为细菌纳米纤维素），具备良好的弹性、聚合性、延展性、可降解性[2-3]。目前，细菌纤维素广泛应用于食品、化妆品、医用敷料、人工角膜和复合材料等领域[4-8]，被誉为21世纪最具发展前景的生物材料[9-10]。
目前，国内外对细菌纳米纤维素相关方面的研究开展了大量工作，如高产菌株选育、发酵工艺条件优化、操作方式和代谢机理等[11-13]。但是，制约细菌纤维素产业发展的主要原因是生产成本过高，其关键之处在于发酵效率较低和生产原料成本过高。因此，利用废弃物如酒糟浸出液、黄水等生产细菌纤维素一方面可以降低生产成本，另一方面实现了废弃物的资源化利用[14-16]。GAYATHRI G等[17]利用筛选获得的Komagataeibacter saccharivorans发酵废弃酒糟，细菌纤维素产量为1.24 g/L；
张沙沙等[18]利用木薯水解液为发酵培养基，将细菌纤维素的产量提高到5.75 g/L，但是单位体积产量仍然不能满足工业化生产需要。王英男等[19]以乳清液为发酵基质生产细菌纤维素，实现了产量的显著提升，但是原料成本过高，且资源局限。另一方面，我国酿酒工业发达，废弃酒糟产量巨大，酒糟中残留的淀粉、蛋白质和氨基酸丰富，具有开发为细菌纤维素生产原料的潜力。贺富强等[20]用白酒糟酶解液作为促进剂添加到细菌纤维素的基础培养基中，研究表明，酒糟中含有促进细菌纤维素产量提升的活性因子，细菌纤维素产量为4.84 g/L，较对照提升了135.3%。马霞等[21]采用响应面试验设计优化了细菌纤维素的发酵条件，并添加黄酒酒糟浸出液，在发酵温度30 ℃的条件下，培养7 d后的细菌纤维素产量为14.44 g/L，较优化前提高了1.5倍。
在研究文献和前期工作的基础上，认为利用自有的高性能细菌纤维素生产菌株，可以将黄酒酒糟酶解液作为基础培养基，并充分发挥酒糟中活性因子的促进作用，只需添加部分营养物，实现细菌纤维素的高产，降低原料成本。因此，本研究将通过对黄酒酒糟酶解液发酵生产细菌纤维素的工艺条件进行系统优化，以期为细菌纤维素的低成本高产发酵开辟一条新的途径。
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
新鲜黄酒酒糟：浙江嘉善黄酒股份有限公司；
红茶（金骏眉900）：福建南平市一杯香茶叶有限公司；
木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）BC19-2：本实验室驯化，菌体浓度为108个/mL，4 ℃保存备用。
1.1.2 试剂
蔗糖：云南滇鹏糖业有限公司；
葡萄糖、柠檬酸、氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司；
酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；
蛋白胨：杭州微生物试剂有限公司；
无水乙醇、乙酸：江苏强盛功能化学股份有限公司；
葡糖淀粉酶（酶活260 000 U/mL）：沧州夏盛酶生物技术有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
细菌纤维素发酵初始培养基：蔗糖10 g，红茶2 g，水100 mL，pH 5.0。煮沸后采用三层纱布过滤后取上清液，冷却至室温。
1.2 仪器与设备
BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；
THZ-92B台式恒温培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；
WB-6数显恒温水浴锅：常州迈诺仪器有限公司；
LGJ-10真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酒糟酶解液的制备
将新鲜的黄酒酒糟用搅拌器打碎，按照酒糟干质量加入3倍质量的水，然后加入总体积0.5%的葡糖淀粉酶（酶活260 000 U/mL），充分搅拌均匀，在酶解温度60 ℃条件下酶解3 h后用纱布过滤制得酒糟酶解液，备用。
1.3.2 细菌纤维素的发酵制备
于配制好的细菌纤维素发酵初始培养基中接种6%实验室保存的木葡糖酸醋杆菌BC19-2，25 ℃恒温静置培养5 d，待培养液表面长出细菌纤维素膜，定期称量并计算细菌纤维素的产量。
1.3.3 细菌纤维素的制备条件优化单因素试验
家庭也有用缸贮藏番茄的，其方法是将缸冲刷干净，然后把选好的番茄装入缸内，装缸时以3～4个果高为一层，每层之间要设支架隔离以防挤压损伤，装满后用塑料薄膜封缸口，15～20天打开检查一次，迅速挑出烂果实，然后重新装缸密封，继续贮藏。
分别考察不同培养基组成的碳源（2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖、葡萄糖、新鲜黄酒酒糟酶解液），氮源（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的复合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶1）、硝酸铵及1 g/100 mL、1.5 g/100 mL、2 g/100 mL、2.5 g/100 mL、3 g/100 mL的红茶）；
初始pH（3、4、5、6、7）、培养温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%）；
黄酒酒糟酶解液酶解时间（0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、酶解液体积分数（10%、30%、50%、70%、90%）对细菌纤维素产量的影响。
1.3.4 测定方法
采用称质量法（湿质量）测定细菌纤维素产量：取出纤维素膜，冲洗干净；
而用酒糟酶解液发酵而成的细菌纤维素膜背面会残留一层酒糟渣颗粒，需用手轻轻搓洗干净，之后置于纱布上方沥干20 min后称质量[22]。
1.3.5 细菌纤维素膜的表征
参考张雯等[23]的方法并做适当的修改：将发酵完成后所得到的细菌纤维素膜清洗干净之后，浸泡于0.1 mol/L的NaOH中，置于烧杯内在水浴锅中90 ℃水浴加热。反复换碱液若干次直至纤维素膜呈半透明状。将膜取出用蒸馏水洗净，放入冰箱-18 ℃预冻至定型，进行真空冷冻干燥，制得冻干的细菌纤维素膜。参照文献[22]进行电镜检测。
2.1 培养基组成对细菌纤维素产量的影响
2.1.1 碳源对细菌纤维素产量的影响
由图1可知，随着碳源添加量的增加，细菌纤维素的产量也均有所增加，但在添加量达到6%之后，细菌纤维素的产量趋于平稳。由此可以看出，在碳源浓度较低时，随着碳源添加量的增加，木葡糖酸醋杆菌生长更快，细菌纤维素产量越高；
另一方面，3种碳源中以酒糟酶解液为碳源时细菌纤维素产量最大（24.8 g/L），以蔗糖为碳源时产量最小。基于对细菌纤维素发酵初始培养基的比较，进一步考察了3种碳源添加量均为10%时细菌纤维素的发酵能力，酒糟酶解液产细菌纤维素能力最强（24.6 g/L），葡萄糖次之（23.2 g/L），蔗糖最低（20.8 g/L），因此，最佳碳源为酒糟酶解液，最佳添加量为6%。
图1 不同碳源添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.1 Effect of different carbon source addition on bacterial cellulose yield
2.1.2 氮源对细菌纤维素产量的影响
图2 不同氮源添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.2 Effect of different nitrogen source addition on bacterial cellulose yield
2.2 培养条件对细菌纤维素产量的影响
2.2.1 初始pH值对细菌纤维素产量的影响
由图3可知，细菌纤维素产量在培养基初始pH值为6时达到最高。木葡糖酸醋杆菌是醋酸菌属，喜好偏弱酸性的环境，太高或太低的pH值都会对菌种的生长与产细菌纤维素能力产生负面影响[24]。因此，最佳初始pH值为6。
图3 初始pH值对细菌纤维素产量的影响Fig.3 Effect of initial pH value on bacterial cellulose yield
2.2.2 培养温度对细菌纤维素产量的影响
由图4可知，随着培养温度的升高，细菌纤维素的产量增高，在30 ℃时达到峰值；
温度继续升高时，细菌纤维素产量则会减少；
培养温度达到40 ℃时，木葡糖酸醋杆菌便不再产细菌纤维素。由此可见，低温时木葡糖酸醋杆菌生长缓慢，细菌纤维素形成耗时长，而温度过高则会导致木葡糖酸醋杆菌休眠或死亡，无法产生细菌纤维素[25]。因此，最佳培养温度为30 ℃。
图4 培养温度对细菌纤维素产量的影响Fig.4 Effect of culture temperature on bacterial cellulose yield
2.2.3 接种量对细菌纤维素产量的影响
由图5可知，随着菌液接种量增加，细菌纤维素产量也随之增加，当接种量达6%后，细菌纤维素产量达到峰值；
继续增加接种量，细菌纤维素产量随之减少。接种量过大将不利于细菌生长，还易引起发酵过程中溶氧不足的问题，影响产物细菌纤维素合成；
接种量过小时木葡糖酸醋杆菌生长缓慢，培养时间过长，产物细菌纤维素生产效率低。因此，最佳接种量为6%。
图5 接种量对细菌纤维素产量的影响Fig.5 Effect of inoculum on bacterial cellulose yield
2.3 酒糟酶解条件对细菌纤维素产量的影响
2.3.1 酶解时间对细菌纤维素产量的影响
由图6可知，在酒糟酶解过程中，随酶解时间增加，细菌纤维素产量增加，在酶解3 h时达到峰值；
酶解时间超过3 h之后，细菌纤维素的产量稍有减小。因此，黄酒糟酶解处理的最佳酶解时间为3 h。
图6 酶解时间对细菌纤维素产量的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on bacterial cellulose yield
2.3.2 酒糟酶解液体积分数对细菌纤维素产量的影响
由图7可知，当酒糟酶解液体积分数为10%时，细菌纤维素产量极低；
酒糟酶解液体积分数30%后有明显提高，酒糟酶解液体积分数为90%时，细菌纤维素产量最高，达到26.5 g/L。酒糟酶解液中含有丰富的木葡糖酸醋杆菌产细菌纤维素所需的营养物质，浓度越高越利于菌群生长。由此可见，酒糟酶解液直接用作培养基进行细菌纤维素发酵是可行的，酒糟酶解液最佳体积分数为90%。
图7 酶解液体积分数对细菌纤维素产量的影响Fig.7 Effect of enzymatic liquid volume fraction on bacterial cellulose yield
2.4 细菌纤维素膜的含水量
通过测定发现，未碱洗的细菌纤维素膜含水量为92.8%；
碱洗后的细菌纤维素膜含水量为99.0%。由此可知，细菌纤维素膜具有极好的持水性，碱洗后的细菌纤维素膜相较于未碱洗的细菌纤维素膜，持水性更好。
2.5 细菌纤维素膜的显微观察
由图8可知，得到的细菌纤维素膜均为由纤细状纤维丝组成的三维立体纳米级网状结构，多孔且结构紧密。而碱洗后再干燥的细菌纤维素膜（图8b）相较于未碱洗直接干燥的细菌纤维素膜（图8a），其纤维丝上附着的残余营养物质被洗去，纤维丝之间的粘连程度更低，结构更致密，更有利于其后期作为材料的应用。
图8 细菌纤维素膜冷冻干燥后的扫描电镜图Fig.8 Scanning electron microscopy of bacterial cellulose membrane after freeze drying
木葡糖酸醋杆菌BC19-2发酵培养生产细菌纤维素的优化条件：培养基组成为黄酒糟酶解液6%、红茶2 g/100 mL；
培养条件为初始pH 6.0、培养温度30 ℃、接种量6%；
黄酒糟酶解条件为酶解时间3 h，黄酒糟酶解液体积分数90%。在此条件下细菌纤维素产量最高为26.5 g/L，解决了培养基中残留的红茶渣对纤维素膜品质影响问题。碱洗后的细菌纤维素膜含水量为99%，极好的持水能力展现了在医药等领域的良好应用前景。