杨善鹏, 任童童，王 明, 尹东锋, 王晓锋*
1.新疆军区总医院药剂科，乌鲁木齐 830000；
2.新疆医科大学第五附属医院，乌鲁木齐 830011
verubulin(MPC-6827，Azixa，EP128495，化合物1，见图1)化学名称为N-甲基-2-甲基-4-甲氧基苯胺基喹唑啉，是一种作用于微管蛋白上秋水仙碱结合位点的新型微管聚集抑制剂，通过抑制微管的形成，使肿瘤细胞生长停滞在G2/M期并诱发凋亡，体外对多种肿瘤细胞表现出良好的增殖抑制活性[1-6]。化合物2(见图1)为1的结构衍生物，在体外也表现出良好的生物活性，尤其是解析了2与微管蛋白的复合晶体结构(PDB编码：6BR1)，为该类化合物的进一步结构修饰奠定了基础[7]。化合物3(见图1)是DOHLE等[8]报道的另一类作用于秋水仙碱结合位点的新型微管聚集抑制剂，同时也解析了其与微管蛋白的复合晶体结构(PDB编码：5OSK)。通过将6BR1和5OSK进行叠合，并对复合晶体结构中配体构象及与微管蛋白相互作用方式进行分析，我们设想在1的结构中引入类似3中氨基磺酸酯基的基团，由此设计了化合物4a和4b。见图1，对其分别进行了分子对接、化学合成和体外活性评价。
1.1 仪器
磁力搅拌器(德国IKA公司)；
RY-Ⅰ型熔点仪(天津市天分分析仪器厂)；
JNM-ECA-400型超导核磁共振仪(日本电子株式会社)；
Xevo G2-XS QTOF高分辨质谱仪(沃特世公司)；
分子模拟软件Discovery Studio 3.0(Accelrys，San Diego，USA)。
1.2 试药
2-甲基-4-氯喹唑啉(质量分数为98%)，3-硝基-4-甲氧基苯胺(质量分数为98%)，3-苄氧基-4-甲氧基苯胺(质量分数为98%)，碘甲烷(质量分数为99%)，氢化钠(分散在矿物油中，含量为60%)，钯碳(10% Pd, 还原型, 含水约55%)，氨基磺酰氯(质量分数为97%)，二异丙基乙基胺(质量分数为99.5%)，均购自上海泰坦科技有限公司；
无水硫酸钠，氯化钠，N,N-二甲基乙酰胺，四氢呋喃，异丙醇，乙酸乙酯，石油醚，乙醚，硅藻土均为分析纯，均购自新疆安谱实验器材有限公司；
GF254硅胶板和柱层析硅胶(200目)，购自青岛海洋化工有限公司。
图1 化合物1～4的结构
1.3 细胞株
人乳腺癌细胞MCF-7购自南京凯基生物科技发展有限公司。
2.1 4a和4b的计算机辅助设计
本文所选用的复合晶体结构数据均来源于Protein Data Bank(www.rcsb.org)，编号分别为5OSK和6BR1。蛋白结构准备和分子对接所使用的软件为Discovery Studio 3.0(DS3.0)。
2.1.1蛋白结构5OSK和6BR1的准备和叠合 蛋白结构5OSK和6BR1的预处理[9]：保留晶体结构中1个α、β二聚体及配体小分子和金属离子，并保留5OSK中的水分子615和6BR1中的水分子675，将其余部分删除;利用Prepare Protein模块进行了蛋白结构准备，程序设置中除保留水分子外，其余默认;利用Molecular Overlay模块对准备好的蛋白进行一致性叠合，立体因素和静电因素各按50%概率计算。
叠合发现，二者相似度为0.895，2和3中B环上的甲氧基几近重合，而3中的氨基磺酸酯基诱导氨基酸残基βN349、βK352向其靠近并分别与之形成氢键，显示出额外的相互作用见图2，提示在1中引入类似基团可能会增加其与微管蛋白的相互作用，由此设计了4a和4b，并进行了分子对接。
2.1.24a和4b与蛋白结构5OSK的分子对接 以2.1.1中准备好的5OSK为目标对接蛋白，结合位点是以3为中心、10 Å为半径的球形区域。配体小分子利用Full Minimization模块进行了能量最小化，并添加了Chemistry at Harvard Macromolecular Mechamics(CHARMM)力场。对接利用CDOCKER模块进行，参数按程序默认设置，主要包括随机构象产生、构象优化和模拟退火等。对接结果采用Generalized Born with Molecular Volume(GBMV)溶剂模型计算结合能[9-10]。
注：6BR1和5OSK结构中的氨基酸残基分别用灰色、青色线状图表示，化合物2、3分别用灰色、青色棍状图表示。
首先使用3对对接方法进行了验证，结果显示最优构象与蛋白结构中配体构象的走向基本一致，RMSD值为0.746 Å，结合能为-44.03 kcal·mol-1，提示对接方法效果较好。4a和4b的对接结果提示其与微管蛋白也有较好的结合，结合能分别为-39.08、-33.33 kcal·mol-1。其中4a的结合能更低，新引入的氨基磺酰胺基与原配体中的氨基磺酸酯基走向较为一致，分别与氨基酸残基βN349形成1根氢键、与βK352形成2根氢键，但未像3可另外与αV181、βN349及作为氢键传递的水分子615形成氢键。见图3。
注：氨基酸残基用浅灰色线状图表示；
化合物3和4a分别用青色和橙色棍状图表示；
氢键用绿色虚线表示，氢键的距离<3 Å。
2.2 化学合成
2.2.1化合物的合成及表征 以5和6为原料，通过4步反应合成了目标化合物4。合成路线见图4。
2.2.1.1化合物7a的合成 室温下，将2-甲基-4-氯喹唑啉(5，179 mg，1 mmol)和3-硝基-4-甲氧基苯胺(6a，168 mg，1 mmol)溶于5 mL异丙醇中，加入1滴浓盐酸，然后升温至50 ℃搅拌12 h[11]。冷却至室温，析出固体物，抽滤，用5 mL预先冷至4 ℃的异丙醇洗，真空干燥，得到土黄色固体258 mg，即化合物7a。收率：83%；
熔点：246～248 ℃；
1H NMR(400 MHz,d-DMSO)δ(ppm)9.91(s, 1H)，8.60(d,J=2.4 Hz,1H)，8.48(d,J=8.0 Hz,1H)，8.22(dd,J=9.1, 2.6 Hz, 1H)，7.82(dd,J=11.0, 4.0 Hz,1H)，7.71(d,J=8.2 Hz, 1H)，7.58(dd,J=11.2, 4.0 Hz,1H)，7.43(d,J=9.2 Hz, 1H)，3.94(s, 3H)，2.53(s, 3H)；
HR-ESI-MS m/z 311.114 1 [M+H]+(计算值311.113 9, C16H14N4O3)。
2.2.1.2化合物7b的合成 室温下，将2-甲基-4-氯喹唑啉(5，178 mg，1 mmol)和3-苄氧基-4-甲氧基苯胺(6b，229 mg，1 mmol)溶于5 mL异丙醇中，加入1滴浓盐酸，然后升温至50 ℃搅拌12 h。将反应液倒入50 mL冰水中，调pH值至7，析出固体物，抽滤，干燥，得到黄色固体324 mg，即化合物7b。收率：87%；
熔点：233～235 ℃；
1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)11.37(brs, 1H)，8.78(d,J=9.2 Hz, 1H)，8.06(t,J=7.6 Hz, 1H)，7.88(d,J=8.0 Hz, 1H)，7.81(t,J=8.0 Hz,1H)，7.54(d,J=2.0 Hz, 1H)，7.47(d,J=7.1 Hz, 2H)，7.41(t,J=7.4 Hz, 2H)，7.36(d,J=7.1 Hz, 1H)，7.31(dd,J=8.7,2.2 Hz,1H)，7.09(d,J=8.7 Hz, 1H)，5.11(s, 2H)，3.83(s, 3H)，2.59(s,3H)；
HR-ESI-MS m/z 372.1711[M+H]+(计算值372.170 7,C23H21N3O2)。
注：试剂及条件：a.cHCl, i-PrOH,50 ℃,12 h; b.CH3I, NaH (60% in oil),THF, 0 ℃～rt, 2 h; c.i.Pd/C,H2, AcOEt, rt, 12 h; ii. ClSO2NH2, DIPEA (for 4a), DMAc, 0 ℃～rt, 24 h。
2.2.1.3化合物8a的合成 室温下，将2-甲基-4-(3-硝基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(7a，156 mg，0.5 mmol)溶于5 mL无水四氢呋喃中，冰浴冷却至0 ℃后加入氢化钠(61 mg, 分散在矿物油中，含量为60%，1.5 mmol)，搅拌5 min后，加入碘甲烷(143 mg，1 mmol)，继续在该温度下搅拌30 min后，升温至室温反应2 h。将反应物倒入50 mL冰水中，析出固体物，抽滤，干燥。粗品经柱色谱分离(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)，得到土黄色固体135 mg，即化合物8a。收率：83%；
熔点：98～201 ℃；
1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ(ppm)7.83(d,J=8.4 Hz,1H), 7.75(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.64～7.57(m,1H),7.23(dd,J=9.2, 2.8 Hz, 1H), 7.08～7.09(m,J=4.7,2H),7.03(d,J=8.8 Hz, 1H),3.98(s, 3H),3.62(s, 3H),2.76(s,3H)；
HR-ESI-MS m/z 325.130 2[M+H]+(计算值325.129 5, C17H16N4O3)。
2.2.1.4化合物8b的合成 室温下，将2-甲基-4-(3-苄氧基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(7b，188 mg，0.5 mmol)溶于5 mL无水四氢呋喃中，冰浴冷却至0 ℃后加入氢化钠(63 mg，分散在矿物油中，含量为60%，1.6 mmol)，搅拌5 min后，加入碘甲烷(145 mg，1.0 mmol)，继续在该温度下搅拌30 min后，升温至室温反应2 h。将反应物倒入50 mL冰水中，析出固体物，抽滤，干燥。粗品经柱色谱分离(乙酸乙酯∶石油醚=1∶2)，得到白色固体176 mg，即化合物8b。收率：91%；
熔点：136～138℃；
1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ(ppm)7.78(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.57～7.50(m, 1H), 7.39～7.22(m, 5H), 6.91～6.93(m, 2H), 6.86(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71～6.75(m, 2H), 5.06(s, 2H), 3.92(s, 3H), 3.55(s, 3H), 2.73(s, 3H)；
HR-ESI-MS m/z 386.186 8[M+H]+(计算值 386.186 3,C24H23N3O2)。
2.2.1.5化合物4a的合成 室温下，将N-甲基2-甲基-4-(3-硝基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(8a，98 mg，0.3 mmol)溶于15 mL乙酸乙酯中，在氢气氛下加入钯碳(40 mg，10%)，搅拌反应12 h。通过硅藻土滤除钯碳，滤液减压蒸干得到固体，即N-甲基-2-甲基-4-(3-氨基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉。室温下，取上述固体(85 mg，0.29 mmol)溶于3 mLN,N-二甲基乙酰胺中，冰浴冷却至0 ℃，依次加入二异丙基乙基胺(101 μL，0.58 mmol)和氨基磺酰氯(67 mg，0.58 mmol)，在该温度下搅拌30 min后，升温至室温反应24 h。将反应液倒入40 mL冰水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压除去乙酸乙酯，向其中加入10 mL乙醚，剧烈搅拌10 min，倾沘出乙醚后，得到黄色固体物61 mg，即化合物4a[12]。收率：54 %；
熔点：199～201 ℃；
1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)8.28(s, 1H), 7.64(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.62～7.54(m, 1H), 7.36(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.22(s, 2H), 7.02～7.09(m, 2H), 6.98(d,J=8.8 Hz, 1H), 6.79(dd,J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.51(s, 3H), 2.59(s, 3H)；
HR-ESI-MS m/z 374.128 8[M+H]+(计算值 374.128 1, C17H19N5O3S)。
2.2.1.6化合物4b的合成 室温下，将N-甲基2-甲基-4-(3-苄氧基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(8b，135 mg，0.35 mmol)溶于20 mL乙酸乙酯中，然后在氢气氛下加入钯碳(105 mg，10%)，搅拌反应12 h。通过硅藻土滤除钯碳，滤液减压蒸干得到固体，即N-甲基-2-甲基-4-(3-羟基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉。室温下，取上述固体(104 mg，0.35 mmol)溶于4 mLN,N-二甲基乙酰胺中，加入氨基磺酰氯(122 mg，1.05 mmol)，搅拌，反应24 h。将反应液倒入40 mL冰水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压除去乙酸乙酯，向其中加入10 mL乙醚，剧烈搅拌10 min，倾沘出乙醚后，得到白色固体物73 mg，即化合物4b[8]。收率：56%；
熔点：183～185℃；
1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)8.00(s, 2H), 7.74～7.55(m, 2H), 7.23(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.09～7.18(m, 3H), 7.03(d,J=8.4 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.52(s, 3H), 2.60(s, 3H)；
HR-ESI-MS m/z 375.112 8 [M+H]+(计算值 375.112 2, C17H18N4O4S)。
2.3 体外MCF-7肿瘤细胞增殖抑制活性筛选
取处于对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞接种于96孔板中，密度为1×104cells·孔-1，每孔加入100 μL细胞悬液，空白组不加细胞培养基，四周边孔中加入PBS防止边缘效应。37 ℃下培养24 h后弃去上清液，空白组和对照组各加入100 μL不含药物的培养基，实验组分别加入质量浓度100 μg·mL-1倍比浓度梯度稀释的100 μL含阳性药、4a和4b的培养基，每组设定5个复孔。继续培养48 h后，弃去上清液，每孔加入10 μL的CCK8溶液，培养4 h后，除去上清液，用酶标仪测定492 nm处的吸光度值，计算细胞生长抑制率。根据药物浓度与抑制率作图，计算GI50值，实验平行3次[13-16]。阳性药为1。
经测定，4a和4b均有较好的体外肿瘤细胞增殖抑制活性，其中4a的活性略强于4b，但均较1有所降低，见表1。
2.4 体外微管蛋白聚集抑制活性筛选
利用循环离心法制备的猪脑微管蛋白进行活性测试[17-18]。将不同浓度的药物与微管蛋白孵化后，在冰浴下加入GDP，然后转移到0 ℃的比色杯中，随后升温至37 ℃，测定该过程中340 nm下的吸光度值。与对照组比较，计算出不同药物浓度下的抑制率。然后根据药物浓度与抑制率作图，计算IC50值，实验平行2次。阳性药为CA-4。
经实验测定，4a和4b都表现出了一定的微管聚集抑制活性，其中4a的活性是4b的6倍多，但显著低于1和CA-4，见表1。
表1 4a、4b抑制MCF-7细胞增殖的GI50值、抑制微管聚集的IC50值和ClgP值
本实验通过将2、3与微管蛋白的复合晶体结构进行叠合，利用“拼合”策略设计了1的结构衍生物4a和4b，并通过亲核取代、甲基化、还原和磺酰化4步反应对目标化合物进行了合成，总收率分别为37%、44%，目标化合物及中间体结构经1H-NMR和HR-ESI-MS确证。
在MCF-7细胞增殖抑制活性评价中，4a和4b显示出较强的活性，仅略弱于1，达到了次纳摩尔水平。但是，在微管聚集抑制实验中，4a和4b均未显示出预期的活性，尤其是4b仅表现出非常弱的微管聚集抑制活性。分析靶标活性和细胞活性不一致的可能原因[19]：一是新引入的基团可能改变了化合物与微管蛋白的结合方式，降低了与微管蛋白的亲和力，从而导致微管聚集抑制活性下降，但是仍不能排除化合物作用于微管蛋白后会导致的其他效应；
二是化合物可能作用于其他未知靶标，需要进行细胞周期阻滞、肿瘤信号通路阻滞方面的研究。4a和4b表现出较好的肿瘤细胞增殖抑制活性，可能与化合物类药性改变有关。文献报道的1及其衍生物多表现出脂溶性较强的特点[5]，通过在结构中引入新的基团，降低了化合物的脂溶性使lgP值位于“理想”区间(见表1)[20]，促使化合物更易进入细胞或在细胞中积聚。
总之，本研究在1的结构中引入氨基磺酰基或氨基磺酸酯基，尽管会降低化合物的微管聚集抑制活性，但是肿瘤细胞增殖抑制活性得到基本保持，并改善了类药性，可为相关微管聚集抑制剂的结构修饰提供借鉴。
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