杨晓，李汴生,2*，阮征,2，张德润，李丹丹，雷略焕
（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东广州 510640）（3.怀集县雷氏食品有限公司，广东肇庆 526432）
怀集黄菜是广东省肇庆市怀集县的一种特色农产品，由独特的金黄色泽而得名“黄菜”，又因其以生长期约六十日的萝卜苗为原料，故得名“六十日”[1]。
调研发现，目前黄菜的生产尚未规模化，仍以小型加工厂和家庭作坊生产为主。黄菜的生产制作沿袭传统工艺，其流程为：萝卜叶采收→整叶→清洗→晾晒→烫漂→沥水→两轮重石压榨→加盐装坛→入埕压实→自然发酵，其制作工艺繁琐、耗时较长，生产效率低下。由于发酵微生物菌系不一，黄菜产品品质不稳定。而目前国内外鲜有对怀集黄菜的研究，其自然发酵过程形成的微生物群落组成尚未被揭示，黄菜的菌种资源也未被利用，传统制作工艺如何影响发酵品质的原理也并不清晰，限制了其规模化和产业化。
怀集黄菜在我国传统发酵蔬菜中独树一帜[2]，与韩国马尾萝卜泡菜（Chonggak Kimchi）[3]、印度腌蔬菜（Gundruk）[4]、日本野沢菜（Nozawana）[5]等国外萝卜叶腌菜相比具有地域特色。具体体现在原料和制作工艺上，怀集黄菜以绿色叶菜为主要原料，盐为唯一配料且用量较低的条件下，经干态常温自然发酵，其色泽金黄、口感韧脆，使其从其他发酵叶菜中脱颖而出，其中的菌种资源有待开发。朱琳等[6]对萝卜泡菜微生物菌群的研究显示，在发酵后期，厚壁菌门为主要优势菌门，明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）和片球菌属（Pediococcus）为主要菌属。
随着下一代高通量测序技术的发展，食品组学突破了传统培养方法无法展现微生物组全貌的局限[7]，成为解析复杂微生物群落的有力工具，尤其是扩增子测序被广泛应用于发酵菜制品的研究中[8,9]。本文采用16S rRNA扩增子测序，以揭示四种代表性的自然发酵黄菜中微生物群落组成，并与理化、质构、色度和感官特性进行相关性分析，初步探究影响成品品质的关键微生物菌种，为黄菜发酵传统工艺的改进和发酵菌种的筛选奠定基础。
1.1 材料与试剂
样品：黄菜样品取自当地规模化的黄菜生产区：甘洒镇、怀城镇、凤岗镇，选取四种由代表性加工厂生产的样品，分别为燕王（YW）、燕都（YD）、绿凤（LF）、酸趣（SQ）。
试剂：孟加拉红琼脂、平板计数琼脂，广东环凯微生物科技有限公司；
磷酸氢二钾、铬酸钾、硝酸银、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺等，均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
752N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；
TA-XT2物性测试仪，英国 Stable Micro Systems公司；
CR-400便携式色差仪，日本美能达公司；
Aqua Lab水分活度仪，美国 Decagon公司；
DYCP-32C型琼脂糖水平电泳仪，北京市六一仪器厂；
Qubit 2.0荧光定量仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
T100 PCR仪，美国Bio-Rad公司。
1.3 理化指标测定
pH值：酸度计法；
水分含量：GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》的直接干燥法，水分活度：AquaLab水分活度仪检测；
盐度：GB 5009.44-2016《食品安全国家标准食品中氯化物的测定》的银量法；
亚硝酸盐：GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法；
总酸和氨基酸态氮：GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法。
1.4 质构测定
选择成熟度相同，最靠近萝卜苗植株根部、粗细均匀、剔除菜叶的黄菜菜茎（宽3 mm，压实厚度为1.5 mm），切分成4 cm长的长条，每种黄菜成品平行测定五次。采用TA.XT2i质构仪HDP/BS探头进行剪切力试验，参数设置为：测前速度5.0 mm/s，测试速度1 mm/s，测后上行速度10.0 mm/s，压缩比为60%，触发力为5 g，以最大剪切力（PPF）及剪切力做功（WS）为黄菜质构特性指标。
1.5 色度测定
黄菜样品的色度采用便携式色差仪测定，以白板校正，菜茎和菜叶分别测量，以L*、a*、b*和总色差值表征[10]，分别代表亮度值、红绿度、黄蓝度。
1.6 微生物群落表征
1.6.1 总DNA提取和测序
样品使用无菌袋采集，每份样品包含三个生物学重复。样品在冷藏条件送往实验室，在无菌条件下于磷酸缓冲液中混合均匀，经100 μm滤器去除植物组织，在4 ℃ 12 000 r/min的条件下进行冷冻离心5 min，取离心沉淀采用改良后的 CTAB法提取黄菜微生物总DNA，并通过m=1%琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性，使用Qubit 2.0荧光定量仪精确定量DNA浓度。使用 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物对细菌16S rRNA基因的V3~V4可变区进行扩增，使用Illumina MiSeq 2500平台进行双端测序。
1.6.2 微生物群落结构分析
使用QIIME2的DADA2方法对原始测序数据进行过滤处理，后进行OTU聚类，与silva138/16sbacteria数据库进行比对获得物种注释信息并进行后续分析，Alpha多样性分析、微生物群落与环境因子的冗余分析通过https://www.bioincloud.tech/网站完成。
1.7 感官分析
采用定量描述分析法[11]对黄菜进行感官评定，黄菜性状呈固态不均匀物料，特征感官品质包括外观（色泽、灰度、茎叶的对比度），气味（醇香、酯香、酸香），质构（脆度、硬度、弹性），滋味（酸味、咸味、鲜味）[12]。选择评定论域 U=（外观、气味、质构、滋味、整体可接受度），感官描述定义及标度如表1所示。整体可接受度由各特征按以下权重计算：X=（0.25，0.25，0.25，0.15，0.10），喜好强度采用十分制评分。
表1 黄菜感官指标定义及标度Table 1 Definition of sensory property and preference of Huangcai
在感官分析实验室进行样品制作、样品呈递和评分，由5名感官评审员与5名消费者代表组成感官品评小组，每位评审员均评价4种样品，试验轮数为2。
1.8 数据统计与分析
使用SPSS 17.0进行数据统计，采用Origin Pro 2018C进行绘图。在Python 3.9中进行Spearman相关性分析和p值计算，p＜0.05认为具有显著性差异，使用Cytoscape 3.9.0软件可视化微生物群落和代谢物的相关性。
2.1 自然发酵黄菜物种组成分析
图1 四种黄菜样品中细菌在属、种水平的菌群分布Fig.1 Bacterial community of genera and species level in four Huangcai samples
4组样品获得优化序列平均数为229 007条，按照97%的序列相似度归类为可操作分类单元。4种自然发酵黄菜样品中，共检出292个OTUs，14个细菌门和197个细菌属。门水平上，厚壁菌门（Firmicutes，75.48%）占据主导地位，与其他泡菜研究一致[13]，其次是变形菌门（Proteobacteria，20.75%）、放线菌门（Actinobacteria，1.92%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，1.71%）。黄菜样品中丰度最高的三种优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus，64.18%）、魏斯氏菌属（Weissella，6.09%）、片球菌属（Pediococcus，4.64%），而高苏敏等[14]采用超声、低盐处理发酵的萝卜泡菜中，乳杆菌属、明串珠菌属和假单胞菌属丰度最高；
朱琳等[6]发现亚硝酸盐回落期，明串珠菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属和片球菌属为优势菌属。黄菜样品中丰度最高的菌种分别为植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarumsubsp.Plantarum，37.50%）、消化乳杆菌（Lactobacillus alimentarius，10.96%）、食窦魏斯氏菌（Weissellacibaria，5.98%）、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici，4.64%）。其余菌属包括甲基杆菌属（Methylobacterium，2.97%）、假单胞菌属（Pseudomonas，2.97%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，2.97%）、以及2.26%的Allorthizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium，对应到种水平上为莫氏土壤杆菌（Agrobacterium larrymoorei，2.14%）、人参皂苷乳杆菌（Lactobacillusginsenosidimutans，1.66%）、偶氮假单胞菌（Pseudomonas azotoformans，0.78%），为水体、土壤常见菌属和植物内生菌菌属[15]。
2.2 自然发酵黄菜菌群多样性分析
各个样品的Alpha多样性指数见表2，反映各个样品的物种丰富度、均匀度和测序深度。所有样品的覆盖率（Coverage）均在0.99以上，说明测序对样品菌群的覆盖程度较高，能完整反映黄菜细菌菌群的组成。YD黄菜具有最高的ace和chao1指数，说明其物种丰富度最高，物种数量最多。所有样品中，LF黄菜的simpson指数最低而其shannon指数最高，说明其物种多样性最高。其他发酵食品的研究，如坛子肉[16]、萝卜泡菜[6,13]等，均发现在发酵后期，优势菌群逐渐形成规模而抑制其他微生物生长，样品的物种丰富度和多样性均下降。YD、LF黄菜中的菌群结构多样，主导菌属未形成垄断局面，可能由于发酵程度与其他黄菜相比较低，或原料带入的微生物多样性较高。
表2 四种黄菜样品细菌Alpha多样性指数分析Table 2 Alphadiversity of the bacterial community in four Huangcai samples
2.3 自然发酵黄菜菌群与环境因子间的冗余分析
以理化、质构指标为环境因子，对菌属进行冗余分析。如图2所示，各个圆点代表菌属，丰度最高的十种菌属以红色标识，圆点大小与菌属丰度正相关，可见乳杆菌属Lactobacillus为主导菌属。箭头表示的环境因子的长度越长，表示该环境因子对微生物群落的重要性越高，因此盐度、pH值、水分活度、总酸是影响黄菜微生物种群结构的主导因素，而水分含量则影响较小，与张倩等[17]的研究结果一致。pH值、水分活度是影响微生物生长的重要因素，总酸则常与泡菜产品的风味、稳定性相关[9]，过高的酸度意味着过熟和酸败，SB/T 10756-2012《中华人民共和国国内行业标准-泡菜》中规定泡菜酸度不得超过1.5 g/100 g（以乳酸计），所有样品中总酸含量均在标准范围内。
图2 属水平上菌群与环境因子的RDA分析Fig.2 Redundancy analysis between bacterial genres and physiochemical factors
由各环境因子箭头之间的夹角余弦值、以及物种点在环境因子的投影可推断，pH值和亚硝酸盐含量显著正相关，而乳杆菌属、片球菌属与pH值和亚硝酸盐含量负相关。Patra等[18]、Shang等[19]的研究也发现，非乳酸菌常为硝酸还原菌，在初始发酵阶段丰度较高，导致了泡菜生产前期亚硝峰形成，而乳杆菌属在发酵后期pH值下降至一定程度后占据主导地位，并抑制硝酸还原菌增殖、降解亚硝酸盐从而降低其含量[20]，为泡菜生产的关键菌属。魏斯氏菌属、乳杆菌属与剪切力做功呈正相关关系，说明其对黄菜质构特性有潜在的促进作用。总体来说，乳杆菌属、片球菌属、魏斯氏菌属是影响黄菜品质的主导菌属。
2.4 自然发酵黄菜色度分析
四种黄菜样品的色度指标如表3所示，亮度值L*值越大，说明亮度越高，色泽更鲜艳而灰度较低，其中菜茎的色泽较浅，亮度值较菜叶更容易被感知。YW黄菜菜茎具有最高的亮度值，同时菜叶和菜茎的总色差差值较大，因此菜茎的色泽较鲜艳、对比度明显，感官评价获得较高的评分。a*值为负值时表示绿度，由于黄菜以黄棕色的色泽为主，红绿色调不容易被辨别，因此对黄菜外观影响较小。b*为正值时表示黄色的饱和度，可见LF黄菜具有最高的黄度，但由于其茎、叶的总色差较小，色泽对比度较小，在感官评价中色泽的喜好得分较低。
表3 四种黄菜样品色度指标Table 3 Chromaticity of four Huangcai samples
2.5 自然发酵黄菜感官分析
四种黄菜的感官雷达图如图3所示，结果显示酸香与黄菜的气味、总体接受度评分正相关（p＜0.01），对比度与总体接受度评分正相关（p＜0.01），因此酸香较高、色泽鲜艳的YW黄菜获得最高的总体接受度。黄菜的香味以酸香、醇香为主，但不同黄菜产品的评分差异较大。感官评价显示，黄菜口感以脆性和内聚力为特色，黄菜菜茎的最大剪切力（179~257 g）远高于韩国泡菜（65.2 g）[21]，质构更为坚韧。由于盐度较高，黄菜的味道以咸味为主，因此针对黄菜的低盐发酵工艺有待改进。
图3 四种黄菜感官指标强度雷达图Fig.3 Sensory radar map of four Huangcai samples
2.6 黄菜中种水平群落结构与理化、感官指标相关性
如图4所示，将黄菜种水平中丰度最高的十种菌种与理化、感官指标之间的相关性（Spearman相关系数，|r|＞0.6，p＜0.05）以网络图的形式可视化，菌种和各指标以节点组表示，其中不同菌属的菌种以颜色区分。节点间连线表示其相关性。十种菌种均显示出了与理化、感官指标的相关性，其中植物乳杆菌植物亚种（S1）、乳酸片球菌（S5）与水分含量呈负相关（p＜0.05），说明传统生产工艺中对水分的调控能促进其丰度增加，并促进黄菜的酸味和色泽（p＜0.01），为影响黄菜品质的关键菌种。食窦魏斯氏菌（S4）与黄菜的脆性呈正相关关系（p＜0.05），与张楠笛等[22]的报道相反，这可能由菌株差异性导致。国内关于泡菜中消化乳杆菌的研究较少，汤伟等[23]的研究显示泡菜中分离的消化乳杆菌具有降解亚硝酸盐、清除胆固醇的能力和抗氧化活性，而在黄菜中，消化乳杆菌（S8）与酯香风味正相关，对黄菜的香气产生有一定促进作用，可能为潜在的优良菌种资源。
图4 黄菜菌种群落与理化指标、感官强度指标的相关性Fig.4 Correlations between species community and physiochemical & sensory properties
本研究通过16S rRNA扩增子测序分析了四种自然发酵怀集黄菜的微生物多样性，并进行了理化、色度、质构和感官特性测定，通过RDA分析和Spearman相关系数表征分析黄菜中的微生物群落和各个指标之间的相关性。结果显示，黄菜中共检测到14个细菌门和197个细菌属，厚壁菌门为主要细菌门（Firmicutes，75.48%），乳杆菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、甲基杆菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌和Allorthizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium为主要细菌属；
黄菜样品中丰度最高的菌种为植物乳杆菌植物亚种、消化乳杆菌、食窦魏斯氏菌、乳酸片球菌、莫氏土壤杆菌、人参皂苷乳杆菌和偶氮假单胞菌。
感官评价结果发现黄菜产品以酸香、咸味、良好的脆性为特征，相关性分析结果显示，盐度、pH值、水分活度、总酸是影响黄菜微生物群落的主要因素，乳杆菌属、片球菌属与pH值和亚硝酸盐呈负相关关系，魏斯氏菌属是促进黄菜质构品质的主导菌属，而植物乳杆菌植物亚种、乳酸片球菌为促进黄菜酸味和色泽的关键菌种，食窦魏斯氏菌对黄菜质构的保持具有良好作用。
猜你喜欢泡菜质构球菌马铃薯泥肉丸的加工及其质构特性研究食品安全导刊(2021年21期)2021-08-30槟榔生长期果实形态、质构及果皮成分动态变化规律研究保鲜与加工(2021年1期)2021-02-06雪花泡菜数学大王·中高年级(2019年12期)2019-12-24结节病合并隐球菌病的研究进展国际呼吸杂志(2019年1期)2019-01-28IL-33在隐球菌脑膜炎患者外周血单个核中的表达及临床意义现代检验医学杂志(2016年2期)2016-11-14一株副球菌对邻苯二甲酸酯的降解特性研究环境科技(2016年3期)2016-11-08我只是想吃一碗泡菜恋爱婚姻家庭(2016年18期)2016-07-23应用多重PCR鉴定不同来源肠球菌河南畜牧兽医(2015年19期)2015-10-13玉米角质和粉质胚乳淀粉粒粒径、糊化特性及凝胶质构特性的研究中国粮油学报(2014年7期)2014-02-06