张桄滕，何洪源，黄家栋，周宗贤
（中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038）
新精神活性物质（New psychoactive substance，NPS）又称为“策划药”、“合法兴奋剂”，是继传统毒品和合成毒品后的第三代毒品。全球市场上出现的NPS可根据化学结构分为合成大麻素类（例如5FADB、JWH－018）、合成卡西酮类（例如甲氧麻黄酮）、苯乙胺类（例如2C系列化合物）、哌嗪类（例如N-苄基哌嗪）、色胺类（例如赛洛新）、氨基茚满类（例如2-氨基茚满）、氯胺酮及苯环利定类（例如4-甲氧基苯环利定）、植物类（例如卡痛、恰特草）和其他类（例如阿片类物质）等。对现有滥用药物分子进行轻微修饰合成的NPS能够规避法律监管，以每年几十种的速度出现在毒品市场上［1］，不仅对吸食者个人的身体健康造成损害，还极易引发关联的违法犯罪甚至严重的社会问题，不利于经济发展和社会稳定。
NPS在人体内代谢迅速，尿液和血液中母体化合物的浓度将在短时间内下降，通过分析代谢产物可有效延长NPS的检测窗口期，对毛发、血液或尿液等生物样品的检测十分重要［2］。为了解NPS的代谢研究现状，在Web of science核心合集中，以检索式“（（TS=（new psychoactive substance）） OR TS=（novel psychoactive substance）） AND PY=（2011－2022）”进行检索（2022年10月20日），使用关键词“metabolite”，“metabolism”或“metabolic”对检索结果进行筛选，去重后整理得到786篇相关文献。结果显示，随着NPS的滥用问题日益严重，自2011年以来，NPS代谢相关的研究年度发文量呈上升趋势，2017年已超过80篇，见图1A。使用文献计量分析软件Vosviewer［3］对2017 ~ 2022年发表的相关文献进行分析，显示频次大于15的关键词，合并、清洗后得到125个共现关键词，绘制共现关键词密度图，见图1B。
图1 年度发文量趋势图（A）和共现关键词密度图（B）Fig.1 Trend chart of annual publications（A） and density visualization of co-occurrence keywords（B）
共现关键词密度图能够在一定程度上反映相关领域的研究热点。关键词在文献中出现的频次越高，在密度图中对应节点的颜色越深。在图1B中，“metabolite”、“mass spectrometry”及其相邻节点颜色较深，表明NPS代谢物的确定是该领域的研究热点，质谱法是常用的仪器分析方法。
质谱分析技术能够得到未知化合物的分子量和子离子信息，准确性好、灵敏度高、适用范围广，是目前鉴定NPS及其代谢产物结构的主要分析方法。真实的人体数据是代谢物鉴定的金标准，但由于临床安全性不明和伦理问题，来自人体的样本难以获得，可控的人体研究也无法进行。目前关于人体的代谢研究主要采用与人体代谢相似的体内、体外代谢模型以及代谢预测软件［4－5］等工具进行。本文介绍了除人体以外主要的体内、体外代谢模型，总结了不同模型的适用性和优缺点，综述了近5年报道的基于质谱分析的NPS体内、体外代谢研究，并与已知的人体数据进行了讨论和比较，展望了代谢研究的发展趋势，以期为NPS药代动力学及毒理学等相关研究提供有益参考。
NPS体外代谢使用的代谢模型主要有：重组人源同工酶、肝细胞、肝微粒体、肝S9、肝癌细胞系以及真菌等。细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGT）是人体内代谢反应的主要催化酶，一些研究［6－10］使用重组人源CYP或UGT同工酶的单酶孵育来确定代谢产物和相应的催化酶。由于代谢环境与人体最为相似，原代人肝细胞（PHH）被认为是模拟人体代谢的良好工具。但人肝细胞在体外需要冷冻保存，成本高、易失活且代谢酶表达不稳定。人肝微粒体（HLM）和人肝S9（HLS9）的体外孵育是研究NPS代谢的成熟方法，与PHH相比成本更低、耗时更短。为了减少代谢酶表达水平个体差异的影响，代谢研究选用的PHH、HLM或HLS9应为来自多个供体的混合制品。此外，从肝脏人源化的嵌合体小鼠中分离的肝细胞（PXB-cells）也被用于体外代谢研究［11－12］，但这种方法成本较高，还存在约10%的鼠肝细胞污染［13］。微生物模型能够表达大多数Ⅰ相代谢同工酶，已经成为药物代谢研究中的补充工具［14］，但Ⅱ相代谢酶与人体存在一些差异。
1.1 重组同工酶：CYP与UGT
药物在体内的代谢主要有两个过程，即由单加氧酶CYP催化的Ⅰ相代谢反应和UGT为主要代谢酶的Ⅱ相代谢反应。二者是并存关系，含有羟基的母体化合物或Ⅰ相代谢产物可以在UGT的催化下与辅因子中的葡萄糖醛酸基结合。通过代谢反应，药物分子的水溶性增强，利于排出体外。
Wagmann等［9－10］以10种CYP或FMO3同工酶和13种UGT同工酶对3种苯二氮卓类药物进行单酶孵育，采用液相色谱－高分辨串联质谱（LC－HRMS/MS）鉴定代谢物，并给出了催化Ⅰ相或Ⅱ相代谢反应的同工酶谱。Bergstrand等［6］通过13种UGT同工酶的体外孵育，在9种苯二氮卓类策划药中检测到7种母体的葡萄糖醛酸结合物，确定UGT1A4是Ⅱ相代谢反应主要的催化同工酶。
1.2 人肝细胞
从生物体内分离得到的肝细胞包含代谢所需的全部Ⅰ/Ⅱ相代谢酶、辅因子、药物转运蛋白以及结合蛋白。Fabregat－Safont等［15］首次研究了吲哚卡西酮的代谢情况，采用PHH模型对3种合成卡西酮（4-CEC、4-CPRC和5-PPDI）以及1种苯丙胺（3-FEA）进行体外孵育，采用超高效液相色谱－高分辨质谱（UHPLC－HRMS）鉴定了5-PPDI的12种Ⅰ相代谢物、4-CPRC的2种次要代谢产物，4-CEC和3-FEA未被代谢。Kim等［16］通过混合人肝细胞孵育和液相色谱－高分辨质谱（LC－HRMS）检测表征了苯乙胺类策划药25B－NBF的体外代谢情况。结果表明，CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9和CYP2C19等参与了25B－NBF的羟基化、O-去甲基化等反应，UGT2B7在25B－NBF的葡萄糖醛酸化反应中起重要作用。
1.3 人肝微粒体及人肝S9
通过差速离心法可以从组织匀浆中得到微粒体。肝微粒体含有的代谢酶主要是催化Ⅰ相反应的CYP。Seo等［17］采用HLM研究了25N－NBOMe的体外代谢情况，并用液相色谱－四极杆飞行时间质谱（LC－QTOF MS）对代谢产物进行了结构表征。25N－NBOMe在HLM中的生物转化包括羟基化、O-脱甲基化、N-脱烷基化、硝基还原、脱氢、羰基化及其组合，羟基化产物是最丰富的Ⅰ相代谢物。
S9是将组织匀浆9 000 g离心后得到的上清液。肝S9含有肝的重要酶系，其中包括负责药物代谢的CYP等单加氧酶、葡萄糖醛酸转移酶、硫酸转移酶以及一些脱氢酶和氧化酶等。Caspar等［18］采用混合人肝S9（pHLS9）模型和大鼠模型对4-EA－NBOMe进行了代谢表征，在pHLS9体外模型中鉴定了13种Ⅰ相代谢物和5种Ⅱ相代谢物，低于大鼠尿液中的代谢物数量，可能是物种差异和大鼠代谢时间长所致，但4-EA－NBOMe在两种模型中的O-脱甲基化、O-脱甲氧基苄基化、羟基化和氧化等代谢途径相似。
1.4 人肝癌细胞系：HepG2及HepaRG
作为PHH的替代工具，人肝癌细胞系生存期长、细胞稳定性好、易获得，拥有与PHH相似的代谢酶族及转运蛋白。HepG2细胞是来自人肝癌组织的永生细胞系，成本低、易处理，但一些Ⅰ相代谢酶的表达水平较低。HepaRG细胞系是2002年Gripon等［19］首次从慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌女性患者体内的非瘤组织中分离出来的细胞株，在一定条件下可分化为肝细胞形态和胆管样结构，与PHH相似且代谢酶活性更高。研究表明，HepG2和HepaRG细胞是代谢研究中替代人肝细胞的合适模型。
Richter等［20］研究和比较了8种NPS的代谢物（6种亚甲二氧甲基苯丙胺衍生物和2种生物类似物）在HLM与细胞质基质（pHLM/pHLC）、pHLS9、HepG2和HepaRG细胞模型中的代谢情况。结果表明，在代谢产物总数和丰度方面，HepaRG细胞孵育的结果优于HepG2细胞，HepaRG细胞模型生成的代谢物比pHLM/pHLC或pHLS9略多。Richeval等［21］采用LC－HRMS在HepaRG细胞孵育中确定了呋喃芬太尼Fu－F在pHLM孵育中的所有代谢物以及另外9种次要代谢物。
1.5 真菌：小克银汉霉（Cunninghamella）
小克银汉霉菌属的真菌具有与人体类似的Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶，短刺小克银汉霉、雅致小克银汉霉（C. elegans）和刺孢小克银汉霉等菌株常被应用于药物代谢研究中［14］。与肝癌细胞系相比，微生物模型成本低、方便处理，但存在孵育时间长、实验要求高且代谢酶与人体差异较大等缺点，可以作为体外代谢研究的补充模型。根据Watanabe等［22－23］和Leong等［24］的研究，在雅致小克银汉霉孵育中能够鉴定出5F－PB－22、PB－22、XLR－11、UR－144、AM1220和4F－MDMB－BINACA 6种合成大麻素的Ⅰ相和Ⅱ相代谢物，但Grafinger等［25］在雅致小克银汉霉孵育中却未能检测到二甲基色胺（DMT）、N-乙基-4-羟基-N-甲基色胺（4-HO－MET）、N，N-二烯丙基-5-甲氧基色胺（5-MeO－DALT）和5-甲氧基-N，N-二异丙基色胺（5-MeO－MiPT）4种合成色胺类物质的Ⅱ相代谢物，这可能是由于使用了不同的菌株所致。
表1总结了近5年主要NPS体外代谢研究的代谢模型和实验条件。
表1 主要NPS体外代谢研究Table 1 Summary of selected studies using in vitro models for studying the metabolism of NPS
NPS体内代谢研究使用的代谢模型主要有：小鼠、肝脏人源化小鼠、大鼠、猪和斑马鱼等。啮齿类动物是最常用的研究工具，通常在确定的时间段内收集鼠的尿液，以检测不同时期的排泄物。小鼠具有与人类相似的基因，是医学研究常用的模式生物。大鼠和猪体型较大，能够为药代动力学分析提供足够的样本，从而允许高通量的药物筛选。为了减少物种差异而开发和应用的肝脏人源化动物模型及相关技术也在不断发展。除了哺乳动物，斑马鱼（Danio rerio）体内模型在代谢研究中逐渐被广泛应用，在欧盟等国家和地区，使用受精后120 h内的斑马鱼幼体的动物实验不需要伦理审查，但存在与人亲缘关系远、给药途径差异大等缺点。
2.1 小鼠、肝脏人源化小鼠
小鼠与人类间存在大量的同源基因，是培育品系最多的实验动物，作为药物筛选、遗传工程、病理研究的动物模型被广泛应用。Carrola等［32］通过腹腔注射单次给药小鼠，采用高效液相色谱－串联质谱（HPLC－MS/MS）首次对鼠尿中的两种合成卡西酮NEH、BUPH及其Ⅰ相代谢物进行了定性和定量研究，并首次检测到非环取代合成卡西酮的4-芳基羟基代谢物，两种药物的代谢途径与其它N-烷基化卡西酮相同，最主要的Ⅰ相代谢物β-酮-N-脱烷基化合物已被建议作为人体药物暴露的尿液生物标志物［33］。作者使用超高效液相色谱－静电场轨道离子阱高分辨质谱（UPLC－Orbitrap HRMS）在小鼠尿液中初步确定了各种Ⅱ相代谢物，包括N-乙酰化物、葡萄糖醛酸和二羧酸结合物。
用人肝细胞替换小鼠的肝细胞，可以得到拥有人源化肝脏的嵌合体小鼠，肝脏人源化小鼠示意图见图2。人源化肝脏与人类肝细胞的酶学特征十分相似，因此嵌合体小鼠具有更低的物种差异性，成为药代动力学研究有吸引力的动物模型［34］。嵌合体小鼠的肝细胞也被用于体外代谢研究［11］。但人源化技术成本高、操作复杂，嵌合体小鼠体内仍然存在的鼠肝细胞和药物在体内的广泛代谢使物种差异仍然存在。
图2 肝脏人源化小鼠示意图［13］Fig.2 Schematic diagram of liver-humanized mice［13］
Luo等［13］总结了肝脏人源化小鼠的特征，Naritomi等［34］讨论了肝脏人源化小鼠预测药物代谢和药代动力学的现状、问题和发展方向。目前没有发现近5年使用肝脏人源化小鼠模型的体内代谢研究。
2.2 大 鼠
大鼠的体型一般是小鼠的十倍以上，易于采样和药物代谢动态监控，生理功能与人类更相似，且价格低、操作简单，是体内代谢研究常用的哺乳动物模型。Wagmann等［35］采用LC－HRMS/MS分析口服给药后的大鼠尿液和pHLS9孵育产物，研究了3种2C系列化合物2C－E－FLY、2C－EF－FLY和2C－T－7－FLY的代谢情况。初步鉴定出32种代谢产物，主要代谢步骤为羟基化和N-乙酰化。同时采用基于气相色谱－质谱（GC－MS）、液相色谱－串联质谱（LC－MSn）和LC－HRMS/MS的标准尿液筛查方法进行同工酶活性筛选，确定了催化各代谢反应的同工酶。
特定物种肝脏的完整特征无法在任何其他物种中完全概括，这使物种的新陈代谢具有特异性。一些研究报道的嵌合体小鼠的人肝细胞嵌合率（Replacement index > 90%）令人满意［36］，但体型和病理学差异等因素限制了该模型的应用。于是，人们积极开发体型较大的人源化动物模型，例如大鼠、猪等。Zhang等［37］构建了重度免疫缺陷的FAG大鼠，进行确保存活的肝损伤预处理后，将PHH移植到FAG大鼠体内进行可持续增殖，7个月后嵌合率达到30%。该研究开发的预处理方法能够为其他大型物种的人肝细胞移植提供参考，得到的肝脏人源化大鼠具有人肝特有的体内代谢特征，能够为药代动力学研究提供新的工具。
基因编辑技术CRISPR－Cas9获得了2020年诺贝尔化学奖，这种超选择性的精确基因编辑工具简单、高效，可用于建立药物代谢和药代动力学（DMPK）的大鼠模型，如Cyp、Abcb1、Oatp1b2基因敲除大鼠。Lu等［38］总结了利用CRISPR－Cas9建立DMPK大鼠模型的方法，预计该技术有望推动建立新的动物模型和发现药代动力学领域的新成果。
2.3 猪
猪与人的体内代谢具有相似性，且大型实验动物可提供的样本量大、允许多种给药途径，是研究体内代谢的理想模型。Schaefer等［39－40］使用超声波雾化器对猪进行肺部给药后，采用HPLC－MS/MS检测了2种合成大麻素JWH－210、RCS－4和四氢大麻酚（THC）及其代谢物在不同器官和组织的分布情况。结果表明，肾脏和肺部组织是JWH－210死后分析的可行基质，肺部组织是检测RCS－4的合适基质，肝组织、胆汁液以及十二指肠内容物是检测THC的合适基质，胆汁和十二指肠内容物是最适合定量分析代谢物的样本。Doerr等［41］将5F－MDMB－P7AICA原液雾化后使猪吸入，采用LC－HRMS/MS分析猪尿中的代谢产物，并与猪肝微粒体孵育、人肝微粒体孵育以及文献［42－43］报道的其他体内外模型的代谢结果进行比较，结果在猪尿中鉴定了9种I相代谢物和3种Ⅱ相代谢物，并推荐酯水解产物、酯水解+葡萄糖醛酸结合产物和酯水解+羟基化产物作为尿液筛查的目标物。该研究使用猪模型得到的代谢结果与已知的人体数据一致。
2.4 斑马鱼、斑马鱼幼体
斑马鱼是一种生活在淡水中的小型硬骨鱼，最早于20世纪80年代初作为模型动物被Streisinger等［44］应用在遗传学研究中。斑马鱼与人类基因的同源性高达87%，其体内的几种代谢酶在人体内有直系同源物，且体型小、发育快、养殖成本低、繁殖率高，成为一种新兴的代谢模型［45－46］，也被用于NPS毒理学的研究［47－49］。斑马鱼幼体与成年斑马鱼的代谢存在差异，成年斑马鱼与人体代谢的相似性更高［50－51］。
斑马鱼并非哺乳动物，为了评估其模拟代谢的能力，Pesavento等［52］采用斑马鱼幼体模型和小鼠模型研究了芬太尼的体内代谢情况。通过LC－HRMS分析斑马鱼幼体提取物和小鼠尿液，发现芬太尼在两种模型中的代谢特征相似，代谢途径主要包括羟基化、N-氧化和N-脱苯乙基化，去苯乙基芬太尼是最主要的代谢产物。Gampfer等［53］采用LC－HRMS/MS在pHLS9孵育中确定了两种芬太尼类似物4FCy－BAP和Fu－BAP的Ⅰ相和Ⅱ相代谢物，其中大部分在斑马鱼幼体中也能检测到。相比体外模型，斑马鱼或斑马鱼幼体可以被用来观察药物在体内的分布、吸收和排泄等药代动力学过程或毒理学数据，代谢特征也与成熟的啮齿类动物模型相似，逐渐被用于NPS的体内代谢研究中。
近年来，许多学者开始研究合成大麻素类NPS在斑马鱼体内的代谢情况［43，54－58］。Richter等［43］通过在培养基中添加或显微注射卵黄囊使斑马鱼幼体暴露于合成大麻素7′N－5F－ADB，结果在显微注射卵黄囊的幼体中只发现了少量的代谢产物，而通过培养基给药然后对幼体进行分析得到的代谢特征与体外模型的代谢结果相似，是合适的实验方法。Park等［54］进一步考察了采用水体暴露、显微注射不同部位（卵黄囊、尾静脉、心室、后脑）等给药途径时，合成大麻素7′N－5F－ADB在斑马鱼幼体模型中代谢特征的差异，并将结果与文献报道的HepaRG细胞孵育结果［43］和真实人尿样本数据［42］进行比较，结果见表2。在显微注射的斑马鱼幼体中共发现24种代谢物，其中19种也出现在人尿样本（27种）中，匹配率高达70%，表明该方法效果良好。不同的给药途径影响药物在斑马鱼体内的分布等药代动力学过程和代谢特征，注射到心室等重要器官有助于亲脂性NPS在体内的分布和代谢，开展研究工作时应根据实际需要选择合适的给药途径。
表2 7′N－5F－ADB在不同模型中的代谢情况Table 2 Summary of 7′N－5F－ADB and its metabolites in the different models
Wagmann等［8］比较了几类NPS在pHLS9、HepaRG细胞和斑马鱼幼体模型中的代谢情况。结果表明，斑马鱼幼体实验与人类血浆和尿液分析中得到的数据最吻合。目前的研究表明，斑马鱼或斑马鱼幼体是表征NPS代谢情况的一个很有前途的模式生物。
表3总结了近5年主要NPS体内代谢研究的代谢模型和实验条件。
表3 主要NPS体内代谢研究Table 3 Summary of selected studies using in vivo models for studying the metabolism of NPS
由于代谢酶表达不同和物种差异性等原因，利用人体以外的代谢模型获得的代谢物丰度信息并不关键。进行代谢研究是为了通过分析人体生物样本来检测NPS的摄入量，因此代谢物色谱和质谱信息对NPS的尿液筛查十分重要。为了评估体外和体内模型对预测人类生物样本中NPS生物标志物的适用性，应将在代谢模型中检测到的代谢物与人类生物样本中的推荐筛选目标进行比较。对于细胞系统，通常HepG2细胞的代谢特征与人类数据的相似程度最小［20，24］。真菌C. elegans生成的代谢物与人类生物标志物表现出良好的一致性［22，24］。
一些研究比较了不同代谢模型与人体内合成大麻素5F－MDMB－P7AICA的代谢情况［41－43，54］。对于人尿样本中确定的6种丰度最高的人体代谢物［42］，Richter等［43］在pHLS9模型中检测到其中3种，在斑马鱼幼体模型中检测到4种，在HepaRG细胞模型中检测到5种，斑马鱼幼体和HepaRG细胞孵育提供了最全面的人类尿液代谢谱。Doerr等［41］将他们基于猪模型发现的代谢物与人体代谢物进行了比较，并描述了猪尿中类似的代谢物模式。Park等［54］发现显微注射的斑马鱼幼体产生的代谢物与人体代谢物的吻合率高达70%。
Nordmeier等［60］在猪模型中表征的合成阿片类药物U－47700的代谢情况与人体数据相似。Yue等［55］在斑马鱼模型中鉴定了合成大麻素4F－MDMB－BICA的代谢产物，其中12种已在人体样本中被发现，最丰富的酯水解代谢物被认为是确定4F－MDMB－BICA人体摄入的可靠生物标志物［62］。Wohlfarth等［63］发现苯二氮卓类药物Flubromazolam在人肝细胞体外孵育中不能进行广泛的代谢，仅产生少量代谢物，而大鼠体内模型中发现的7种代谢产物大部分可在人体样本中找到。
生理药代动力学（PBPK）模型是通过将人体器官视为独立的隔室，根据生理学和解剖学知识将其整合成一个系统来研究药物的药代动力学。与传统的房室模型相比，PBPK模型的房室和参数更具生理学意义，能够更准确地反映药物在体内的药代动力学过程［64－65］。文献报道了PBPK模型在预测特殊人群的NPS摄入［66－68］、NPS血脑浓度－时间变化［69］和药物相互作用［70］等方面的应用。PBPK模型具有强大的外推能力，可通过纳入代谢模型与人体的药物代谢酶、代谢酶贡献和药代动力学参数等信息，进行单种属或多种属外推，有潜力成为准确推断NPS在人体内代谢途径、代谢物和生物标志物的可靠工具。
一般而言，体外模型操作方便、孵育快速、对设备和人员要求不高，但存在活性有限、代谢酶表达不稳定等缺点；
体内模型能够提供多种给药途径、允许监测药物在体内的分布等药代动力学过程，但对养殖、实验操作要求高，与人类的物种差异性难以解决。不同代谢模型在实验成本、实验操作和酶学特征等方面各有优缺点，应根据具体药物、研究需要等选择合适的代谢模型。
全球的毒品形势不容乐观，新的NPS在市场上不断出现，而相关化合物性质和人体数据难以获得，因此迫切需要通过代谢模型对各类NPS及其主要代谢物进行全面系统的研究，从而更加全面地评估NPS的代谢途径，推断人体摄入的生物标志物。同时，考虑到药物在体内的广泛代谢，还应利用体内代谢模型研究NPS在体内的吸收、分布或排泄等药代动力学过程。此外，大型实验动物的肝脏人源化技术、基于微流控技术的芯片器官以及PBPK模型等新方法的发展可能会为NPS的代谢研究提供新思路。
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