郑耀林，林秋凤，杨 乐，周瑞铮，沈昌莹，易华娟，吴佳锋
（1.东莞市食品药品检验所，广东 东莞 523808；
2.华南理工大学化学与化工学院，广东 广州 510640）
食品安全事关民生福祉，应切实加强食品安全监管，用“四个最严”筑牢舌尖安全的每一道防线。随着社会经济的快速发展，人民生活水平不断提高，对动物源性产品的需求量不断增加，兽药残留问题也越来越受重视[1-2]。兽药的合理使用可预防动物疾病，促进动物生长，提高动物源性食品产量和质量，满足人民群众对肉类蛋白的摄取需求。然而，部分不法商贩盲目追求经济效益，违背动物生长规律，滥用兽药，导致动物源性食品中兽药残留超标问题时有发生，不仅危害人体健康，而且污染环境，给养殖业的健康发展带来极大挑战[3-4]。
耐药性反应是最为常见的兽药残留危害，养殖过程中的不合理用药或者未严格执行休药期规定均会导致兽药在动物源性食品中严重蓄积[5-6]。残留药物通过食物链富集作用在人体内蓄积，产生耐药反应，严重威胁人们的身体健康和药物治疗效果[7-8]。因此，必须对动物源性食品安全监管提出更高要求，为兽药残留检测技术的发展注入更强动力。
目前，兽药残留的检测技术主要依赖液相色谱-三重四极杆串联质谱[9-11]，因其出色的定性、定量能力和高灵敏响应特点，被广泛用于兽药残留检测工作。但是，兽药种类繁多，检验标准多样，给兽药残留的监管和检验工作带来极大挑战[12]。一方面，现有的检验方法多为对已知兽药的定量分析，对动物源性食品中未知兽药的残留风险却难以评估[13-14]；
另一方面，检验标准多样，对检验人员能力和设备性能提出了更高要求，虽然能够相对准确获得检验结果，但检验效率却大打折扣，检验成本高昂，已无法满足人民群众日益增长的食品安全需求。
高分辨质谱是近年来发展较快的检测技术，能够在单次分析中鉴别、定量和确认复杂混合物中更多痕量级的化合物组成[15-16]，在不影响质谱灵敏度、质量分辨率或定量重现性的情况下，获得极其可靠的分析结果，是食品安全[17-20]、代谢组学[21-23]、法医毒理[24-25]、结构解析[26-27]以及成分分析[28-29]等应用领域的研究热点。本文对2018—2021年液相色谱-高分辨质谱联用技术在兽药残留检测分析中的应用情况进行综述，以期为动物源性食品中兽药残留的快速筛查及风险监测提供技术参考和依据。
高分辨质谱是一种分辨率≥104半峰宽、质量准确度＜5×10－6的精确质量分析器。化合物碎片离子进入质量分析器，在外加电磁场的作用下做特征运动，依靠各自强大的信号采集系统和数据分析软件，获得高质量分辨率和高精度的全扫描数据，具备非靶向高通量筛查和定量分析未知化合物的能力[30-31]。高分辨质谱按照质量分析器种类可分为：磁质谱（magnetic mass spectrometry，Magnetic MS）、傅里叶变换离子回旋共振质谱（Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，FTICR MS）、飞行时间质谱（time-of-flight mass spectrometry，TOF MS）以及静电场轨道阱质谱（orbitrap mass spectrometry，Orbitrap MS）。4 种质量分析器的技术特点及其应用如表1所示。Magnetic MS技术经典、成熟、定量能力卓越，但成本高昂、操作复杂等劣势限制了其广泛应用。未发现文献报道将其用于兽药残留的检测，常与气相色谱串联使用，多见于二噁英、多氯联苯等多卤取代的平面芳烃类化合物的检测[32-33]。FTICR MS是分辨率更高、定性能力更好的轨道离子阱质量分析器，但庞大的体积和高昂的维护成本限制其进一步推广使用，一般不用于兽药残留的检测，常见于石油化工[34-35]、蛋白质组学[36-37]、代谢组学[38-39]及中药成分分析[40-41]等领域。TOF MS和Orbitrap MS是目前商品化普及率更高的质量分析器，已被广泛应用于兽药残留检测领域。
表1 高分辨质量分析器的技术特点及其应用Table 1 Technical features and application of HRMS
液相色谱-串联质谱技术将液相色谱的高效分离特点与质谱强大的定性能力完美结合，是评价动物源性食品中兽药残留的常规技术手段[46-47]。高分辨质谱技术的快速发展弥补了三重四极杆质谱在未知化合物检索方面的不足，其强大的定性筛查能力为兽药残留的监督检测和风险监控提供新的技术手段，是兽药残留风险监测和科学研究的热点[48-49]。
2.1 液相色谱-飞行时间质谱
液相色谱-飞行时间质谱具有扫描速度快、灵敏度高、质量范围广等特点，被广泛应用于兽药残留检测领域[50]。如表2所示，王聪等[51]根据农业农村部公告第250号和GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定的禁限用兽药化合物，建立了包含117 种禁限用兽药的标准筛查谱库。该方法使用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱对猪肉中多种类兽药进行筛查和确证，完成了实体标准品向电子标准品的转化，通过标准谱库比对，实现了在无标准品条件下对猪肉中兽药残留进行高通量筛查。该方法简单、灵敏，对目标化合物选择性好，已成功应用于实际样品的检测。田怀香等[52]等采用高效液相色谱-串联飞行时间质谱检测技术，开发了一种生鲜乳中高通量的兽药残留筛查方法。该方法前处理摒弃传统的固相萃取除杂方式，采用冷冻净化除脂技术，不仅缩短了前处理时间，而且增强了目标化合物的筛查效果。样液经液相色谱分离，可在18 min内完成174 种兽药化合物的快速检测，大大提高了兽药的筛查效率。Li Xiaowen等[31]基于高分辨飞行时间质谱建立了141 种禁限用药物筛查谱库，并将其成功应用到猪肉中兽药残留的高通量筛查确证。该方法探究了不同乙腈-水体积分数对目标化合物提取效果的影响，利用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）竞争性络合基质中的金属离子，有效提高四环素类药物的回收率，为兽药残留的快速筛查和定量检测提供有益参考。Magalhães等[53]建立猪肝中45 种抗生素的快速筛查方法，所有化合物在欧盟规定的最大残留限量水平做加标回收实验，准确度、精密度、回收率等方法学验证结果均符合欧盟2002/657/EC准则要求。液相色谱-飞行时间质谱在兽药残留检测中的具体应用见表2。
表2 液相色谱-飞行时间质谱在兽药残留检测中的应用Table 2 Application of liquid chromatography-time of flight mass spectrometry in the detection of veterinary drug residues
2.2 液相色谱-静电场轨道阱质谱
Orbitrap MS是静电场离子阱和傅里叶变换技术的结合，通过提供高质量分辨率和高精度全扫描谱图实现对未知化合物的筛查和确证，已成为动物源性食品中兽药残留检测的研究热点[4]。于慧娟等[12]采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法，建立了鱼虾样品中18 类共计200 种药物残留的快速筛查方法。该方法利用标准溶液收集了200 种药物的保留时间、母离子质荷比及子离子质荷比等特征信息，并将其整合成药物筛查数据库。鱼虾样品经乙腈和乙酸乙酯超声提取，固相萃取柱净化，样液经液相色谱分离后进入Orbitrap进行全扫描，当响应超过阈值离子时自动触发二级子离子扫描以获取详细碎片离子信息。通过标准谱图检索比对进行定性确证，实现了在无标准品情况下对200 种药物残留进行同时检测，单针分析时间仅需22 min。赵善贞等[60]利用同位素稀释和液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术开发了水产品中100 种兽药同时定性、定量分析方法。该方法前处理结合基质分散固相萃取和同位素稀释技术，有效消除定量过程中基质效应的影响。与外标法相比，同位素内标法在基质效应的控制和定性定量信息准确性方面存在明显优势。李云飞等[61]基于静电场轨道阱高分辨质谱技术建立了动物源性食品中33 种兽药残留的检测方法，并建立33 种兽药化合物高分辨质谱标准库，实现非靶向定性筛查。该方法标准库定性确证匹配度高，仅在低含量时（10 μg/kg），响应较低的硝基咪唑类化合物二级碎片丰度比存在较大偏差。Zhao Wentao等[62]建立了一种快速的兽药残留检测方法，并将其应用于动物源性食品中155 种药物的高通量筛查和定量测定。该方法定性准确、灵敏度高，定量限低于常规的检验标准，为兽药残留的监督检验和风险监测提供新思路。液相色谱-静电场轨道阱质谱在兽药残留检测中的具体应用见表3。
表3 液相色谱-静电场轨道阱质谱在兽药残留检测中的应用Table 3 Application of liquid chromatography-electrostatic field orbitrap mass spectrometry in the detection of veterinary drug residues
乙腈具有良好的蛋白沉淀能力，是动物源性食品（主要成分为蛋白质）中兽药提取的首选溶剂[13]。乙腈中酸的浓度对兽药化合物的提取效率产生显著影响，是优化前处理方法的主要研究方向。此外，EDTA可与基质中的金属离子发生络合反应，提高大环内脂类[74]、四环素类[31]药物的回收率。固相萃取作为经典的除杂技术，仍是动物源性食品在兽药残留检测的常用净化手段。QuEChERS法是近年发展较快的前处理方法，该方法通用、快速、高效的特点使其在兽药残留检测中展现出极大的应用前景。研究者可根据不同的基质和目标化合物个性化定制需要的溶剂、盐包和吸附剂等材料，方法应用广泛、可塑性强，更好地迎合了前处理向自动化发展的趋势。此外，功能化的石墨烯、碳纳米管等新型纳米材料也被作为吸附剂成功地应用于兽药的富集和净化过程[50,66,71]，其超高比表面积和丰富的π-π吸附位点为兽药化合物的高效富集提供更多可能，是前处理技术发展的重要方向。
色谱柱填料技术的快速发展提高了单位时间色谱峰容量，优异的分离效果和狭窄的峰宽减少了化合物共流出的发生，为高分辨质谱的检测提供有利基础。反相C18柱是兽药残留检测最为常用的色谱柱，可实现绝大多数非极性兽药的有效分离。而对于少部分极性兽药，亲水相互作用柱可能是更好的选择。
高分辨质谱能够提供高质量精度的全扫描数据，展现出卓越的定性分析能力。飞行时间质谱扫描速度快，能够提供高质量的二级质谱图用于质谱结构鉴定。静电场轨道阱质谱质量分辨率高，能够获得高精确度的一级质谱数据，适用于复杂基质样品的检测。从文献报道的检出限、回收率、精密度等方法学验证结果可以看出，高分辨质谱技术在动物源性食品中兽药残留的高通量非靶向筛查检测方面表现卓越，应用前景广阔。
兽药种类繁多，目前的监督检测手段受检验标准方法制约，难以实现多种类高通量的兽药筛查和定量分析，给动物源性食品安全的监管工作带来不便和风险隐患。高分辨质谱技术的飞速发展给动物源性食品中兽药残留的风险筛查和定量检测提供了新的思路，超高分辨率和质量精度的质量分析器使其在定性筛查方面表现卓越，能够很好地弥补三重四极杆质谱依赖标准品、宽泛性不足的弱点。然而，昂贵的设备价格和维护成本在一定程度上限制了液相色谱-高分辨质谱技术的普及推广；
此外，液相色谱-高分辨质谱数据库仍处于高速发展阶段，尚未形成国际认可、通用统一、类似NIST的标准质谱数据库。截止目前，农业农村部公告第197号-9-2019《畜禽血液和尿液中150 种兽药及其他化合物鉴别和确认液相色谱-高分辨串联质谱法》是唯一一个将高分辨质谱技术应用到兽药残留检验领域的国家标准。随着高分辨质谱的普及应用，高分辨质谱库日趋完善，分析软件和工具更新升级，相信不远的将来会有越来越多简单、快速、高通量的快筛方法被开发应用到兽药残留的风险监测和日常监督检验中，为动物源性食品的监管和生产发展提供更加丰富、高效、科学的技术手段。