黄委委 李鼎鹏 李宁 韩宪富 林德民 李建国 丁聚贤 谢兴文
1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730000 3.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000
骨质疏松症(osteoporosis，OP)作为一类临床常见的代谢性骨病，主要依赖于成骨细胞(osteoblasts，OB)及破骨细胞(osteoclasts，OC)维持骨稳态，骨稳态一旦失衡，就会导致骨量流失和骨密度下降，严重时可引起脆性骨折等问题[1]。近年来，随着人口老龄化程度的不断加剧，患者的正常生活也因OP并发症而受到了非常严重的影响，因此高效而便捷的治疗手段更显得尤为重要[2-3]。大量研究证实[4-7]，正常机体骨骼微环境中的骨膜、骨组织中存在着生理电位，骨细胞可能通过电信号来感知细胞外网络中的机械力，当受到内部或外部电刺激时，骨骼微环境中的相关信号通路、因子分泌可被介导而直接或间接影响OB及OC维持的骨稳态[8-10]。但由于OP发病机制的相关假说较多，电刺激干预OP的相关机制尚未明确，本文从OP相关信号通路及细胞因子角度出发，以阐释电刺激干预OP的潜在机制，从而为OP治疗方案提供一些思路和理论支撑。
1.1 骨压电效应
应力作用引起骨内电位促进骨重建最早由Bassett等发现，并提出相关猜想。Yasuda和Fukada的相关报道也再次证明了压电效应在骨组织中的存在[11]。Gittens等[12]的相关研究发现，骨的动态平衡与骨受力引起的力电相关。其他学者[13]在研究时也发现，骨组织受力变形引起内部液体流动, 载荷信号传递到骨单元,进而产生一系列相关物理效应并被细胞感知而做出相应反应，这些反应就是诱导骨重建的基本机制。也有学者[14]提出，骨压电与胶原及骨组织中的胶原蛋白分子受力后产生的变化有关。
1.2 电刺激概述
电刺激是指采用电流对机体进行干预，并观察其行为效应。常见的电刺激形式有恒定直流电、脉冲直流电和脉冲电磁场3种；
常见刺激方法亦有3种：完全埋入法、半埋入法以及非埋入法[15]。目前，主要应用于心理学研究以及临床疾病的治疗等方面。电刺激作为骨科疾病一种有效治疗手段，在骨折、骨缺损以及软组织损伤等方面优势突出，可促进骨的的修复与再生，其效果受刺激持续时间、频率、波形等条件所限制[16]。研究指出，电刺激可通过改变细胞液氧张力及pH值，产生多种“感应电产物”(如过氧化氢等)促进骨形成。而电刺激引起的电流变化也能激活OC、OB，促进骨细胞生长，从而对机体骨的代谢起着重要作用，这主要体现在促进OC生长和抑制OB生长两个方面。OC在电刺激的作用下，能够激发脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid，DNA) 的合成，有效促进OC增殖[15]。脉冲电磁场刺激OB也会显著增加其脱氧核糖核酸 DNA合成, 加速分裂, 最终显示出快速增殖的细胞群体[17]。相关研究[15]发现，磁场恒定强度下可使OB脱壁或胞质空泡化，进而使其不能形成皱褶膜，最终降低其骨吸收能力。同时，电磁场也会引起环磷酸腺苷(c AMP)水平升高，继而刺激细胞外信号调节激酶(ERK1/2)及蛋白激酶A(PKA)激活[18]。由此可知，电刺激对于OP的防治机制是可循的。
2.1 Wnt/β-catenin信号通路
Wnt/β-catenin作为一个哺乳动物神经干细胞发育关键通路，在细胞增殖、损伤修复调控和OP发病过程中扮演着重要角色[19-20]。
大量研究发现，Wnt/β-catenin通路活化可被外源电刺激强化。在相关动物研究[21]中证实，外源电刺激可明显提高大鼠脊髓组织中Wnt-1和β-catenin mRNA表达水平。低电压(3.5 V)和低频率(1 MHz或2 MHz)交流条件诱导人毛乳头细胞(human dermal papilla cells，hDPC)体外增殖的实验中，也观察到Wnt/β-catenin、Ki67、p-ERK和p-AKT表达显著增加[22]。分析其作用机制可能与Wnt-1和β-catenin蛋白在交感运动神经细胞的表达上调、交感神经的兴奋增加相关[23]。Wnt通路调控中具有重要作用的转录因子7(TCF7)在电休克疗法(electroconvulsive therapy，ECT)中也明显提高[24]，这也证实了电刺激与Wnt/β-catenin通路的相关性。
2.2 BMP/Smads信号通路
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)属转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族，在功能上具有诱导新骨形成的能力[25]。
研究[26]发现，将OB培养在电活性苯胺五聚体(AP)聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)复合材料上并施加电脉冲，聚合物和电脉冲的结合可增强OB成骨分化，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、I型胶原和骨连接素的上调表达以及Samd4的磷酸化。动物实验[27]中也证实了直流电刺激(direct current electric stimulation, DCES)能够上调骨诱导因子的表达，调控新骨的形成和融合，增强OB中BMP-2、BMP-6和BMP-7的正常生理表达。该研究还指出，成骨脊柱器械在融合部位提供集中的DCES，促进了脊柱的机械稳定和新骨形成和骨融合的成骨刺激。此外，DCES也能刺激巨噬细胞释放血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，间接在骨发育与重塑中发挥作用。
2.3 MAPK信号通路
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路作为OB分化和骨形成的正调节因子，属丝/苏氨酸蛋白激酶家族，分为p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路[28]。
2.3.1p38信号通路：作为p38 MAPK通路关键蛋白，p38可介导前凋亡信号、生长抑制信号和炎性反应[29]。过度磷酸化的p38 MAPK可导致OB凋亡[30]。p38 MAPK活化被抑制时，p38 MAPK调控细胞凋亡途径之一的p53磷酸化过程将会受到抑制，细胞凋亡作用也会减弱[31]。研究[32]发现，电刺激坐骨神经损伤大鼠“环跳”穴可抑制p38 MAPK信号转导通路激活，从而使坐骨神经损伤大鼠神经细胞凋亡受到抑制。动物实验[33]中也发现，急性电刺激可通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)或p38信号通路实现诱导骨骼肌细胞过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)转录水平以及翻译后蛋白水平活性上调。
2.3.2JNK信号通路：主要位于细胞质的JNK受到上游信号刺激激活后，移位至细胞核的JNK完全活化并具有酶催化活性，参与细胞调控[34]。部分研究[35]也指出，细胞损伤、凋亡可因JNK被抑制而同样受到抑制。相关动物研究[36]发现，废用性肌萎缩的肌纤维细胞中明显降低磷酸化JNK、ERK1/2、p38 蛋白表达在受到电刺激后明显上调。
2.3.3ERK1/2及ERK5信号通路：ERK1/2属于骨与骨髓中最丰富的p38成员，可被多种来源刺激所激活，促进OB增殖[28,37]。实验研究[38-39]发现，电刺激能够抑制ERK1/2通路活化及抑制损伤脊髓ERK表达。其他研究还提出，直流电场(direct current electric fields ,DCEFs)通过激活细胞内信号通路，可诱导多种细胞定向迁移。超氧物可能通过调节Akt及Erk1/2活化，影响在DCEF诱导的胶质瘤细胞定向迁移[40]。这也证明超氧物在DCEF介导的细胞定向迁移过程中可能作为连接细胞外电刺激与细胞内信号之间的桥梁之一。
2.4 Notch信号通路
Notch通路主要由Notch受体、Jagged配体以及下游Hes因子组成[41]。大量实验研究[42-43]证实，Notch通路在血管新生、OB分化及骨稳态维持中也发挥着极为关键的作用。研究[44]发现，电信号可刺激上调下L929细胞的增殖相关基因-增殖细胞核抗原(Pcna)、两个迁移相关基因-成纤维细胞生长因子2(Fgf2)和δ样非规范Notch配体1(Dlk1)。实验研究[45]证实，内源性神经干细胞的增殖能够通过电刺激抑制Notch通路而达到。分析其机制可能与电刺激通过调控Notch1和mash1的表达抑制了Notch通路有关。
2.5 NF-κB信号通路
核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)作为OP治疗的经典通路，在细胞增殖、分化及机体炎症反应、免疫应答等多种应激反应中也具有重要作用。研究[46-47]指出，电刺激可降低急性心肌缺血(acute myocardial ischemia,AMI)小鼠心肌组织NF-κB p65等相关炎性细胞因子水平及NF-κB p65表达。在相关实验[48]中还证实，电刺激还可通过激活NF-κB信号调控Bcl-2增强抗凋亡作用，减轻肌细胞凋亡。相关动物实验[49]也发现，迷走神经电刺激(vagus nerve stimulation,VNS)能够抑制NF-κB p65和p-IκBα的蛋白表达升高。
2.6 PI3K/Akt信号通路
PI3k/Akt通路作为细胞增殖、凋亡及自噬行为的重要生存通路，在控制骨密度平衡中也具有重要作用[50-51]。相关动物实验[52]指出，电刺激能激活NRG-1/ErbB-PI3K/Akt通路，促进NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA及蛋白的表达。其他研究[53]也发现，电针可激活PI3K/Akt通路改善肌卫星细胞过度自噬，保护肌卫星细胞增殖。
3.1 血管内皮生长因子
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种重要细胞生长因子，在促进血管生成及骨发育、生长和修复的过程中均有重要作用。部分学者[54]研究发现，电刺激能明显升高VEGF、内皮型一氧化氮合酶和血管生成素1水平，并上调血管生成素受体2和VEGF受体2水平，在糖尿病大鼠创面愈合及新血管生成过程中发挥促进作用。其他临床研究也发现，不同类型电刺激配合药物治疗中，VEGF水平均有明显升高，但其具体机制仍需要进一步深入探究。
3.2 成纤维细胞生长因子
研究证实成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)能够促进OB增殖和分化[55]。动物研究[56]发现，电刺激可明显上调缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织细胞生长因子b FGF。但实验[57]指出，治疗效果受到治疗介入时机及持续时间影响。同时，FGF-2 mRNA合成在电刺激后也会有明显增加。这表明电刺激对FGF分泌具有正向作用，在OP治疗中也存在可行性。
3.3 血小板生长因子
血小板生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)增殖、成骨分化过程及新生血管维持中都有着重要作用。研究[58]发现，电刺激足三里、三阴交、梁门穴可提高PDGF含量和改善线粒体超微结构。动物实验也证实，斑块内PDGF-BB、PDGFR-AB表达可在受到电刺激后上调。
电刺激在临床中的应用范围较为广泛。目前，在治疗骨科疾病(如骨折、骨缺损、OP等)方面受到的关注也越来越多，临床也随之开展了一系列研究。相对而言，现有OP方面的临床研究相对薄弱，且主要以改善患者疼痛等症状为主，缺乏较深层次的临床方面的机制研究。姚娜等[59]对相关文献进行了分析、梳理，并探讨了经皮穴位电刺激缓解OP引起的疼痛的机理，认为电刺激可通过调节激素、细胞因子水平、改善血流动力学以及抑制痛觉等，从而起到作用。李桂锦等[60]和时克昌等[61]运用了同样的方法进行了临床试验，即选用益骨汤和经皮穴位电刺激治疗老年性OP疼痛，结果虽然证实了电刺激可改善患者疼痛，但作用机制未予阐明。
综上可知，电刺激作为一种有效的治疗手段，其效果也被大量实验研究予以证实。通过上述对电刺激干预骨形成相关通路及因子的总结可以发现，对相关的重要通路或因子予以电刺激来治疗OP是具有可行性的。因为电刺激可以调控这些关键信号通路和因子，但是部分通路尚缺乏研究验证，且从临床角度而言，电刺激改变生理电位来治疗OP仍存在较多需要解决的问题。首先，如何快速给不同患者制定有效的个体化治疗方案便给电刺激干预带来不小的挑战；
其次，不同种类电刺激的效果差异及电刺激治疗中治疗时机和治疗期间其他组织不良反应等多重因素的影响也是临床治疗中不可忽略的问题。同时，就目前研究而言，大量试验研究尚不能证明电刺激干预OP相关通路及因子对其他相关因子及通路不存在抑制作用，而从治疗的方向而言，以单个信号通路或骨形成相关因子作为治疗的靶点也是明显存在较大限制的。因此，只有把更加深入地探索与临床治疗有机地结合起来，才能在OP治疗和发病机制的研究中取得更大的突破。