韦小白，沈莹，陈静，田伟平
上海市静安区中心医院肿瘤科，上海 200040
肺癌是常见的恶性肿瘤，根据组织学类型可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。NSCLC占肺癌的80%～85%，其中约40%为腺癌，25%～30%为鳞状细胞癌，10%～15%为大细胞癌［1］。黄芩苷是一种重要的类黄酮化合物，从黄芩中草药中分离出来，有抗氧化、抗炎、抗感染和抗肿瘤作用［2］。研究表明，黄芩苷能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞，抑制肿瘤的侵袭和转移［3］。水通道蛋白家族1（APQ1）是具有高选择性的水膜通道蛋白之一，与生物体内水的跨膜转运及水平衡的调节密切相关［4］。有研究表明，敲除AQP1基因，相关肿瘤组织的微血管生成、细胞的生长均受到明显抑制［5］。我们的前期研究发现，人肺腺癌细胞LTEP-A2上AQP1高表达，使用siRNA基因干扰下调AQP1表达后，LTEP-A2细胞的增殖、迁移能力显著下降，细胞凋亡升高；
同时，黄芩苷可降低LTEP-A2细胞增殖、迁移能力，诱导LTEP-A2细胞凋亡，然而其机制仍不清楚。磷酸肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路是一条与增殖、分化和凋亡相关的经典信号通路，Akt途径由PI3K的活化启动，血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、苏氨酸激酶（p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）等相关蛋白均参与PI3K/Akt信号传导过程。2020年1月—2021年6月，本研究进一步探讨就黄芩苷是否通过抑制AQP1从而对肺腺癌细胞增殖、转移、凋亡起到影响，以及该影响是否与PI3K/Akt信号通路有关，以期为肺腺癌的治疗提供新的方向。
1.1 主要材料 人肺腺癌细胞株LTEP-A2购自上海细胞生物学研究所细胞库。黄芩苷购自美国sigma合同（货号：572667，规格1 g），AQP1小干扰siRNA及AQP1过表达载体购自武汉ASPEN生物有限公司，DMEM 培养基购于美国Gibco BRL公司，胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司，LightShift®Chemiluminescent EMSA Kit试剂购自美国Thermo Scientific公司， VEGF、IGF、p-Akt抗体购自英国Abcam公司，mTOR、HIF-1α购自美国CST公司，PI3Kα抑制剂LY294002、磷酸化PI3Kα（p-PI3Kα）抑制剂wortmannin均购自美国Promega公司，PI3K、P-Akt兔抗人一抗购自长沙嘉美生物公司，β-actin一抗购自美国Santa Cruz公司；
山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自碧云天生物技术有限公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒购自武汉阿斯本生物技术有限公司，酶标检测仪购自中国德科公司，流式细胞仪购自美国BD公司，PCR仪购自中国杭州博日科技公司，荧光定量PCR仪购自美国Life technologies公司。
1.2 黄芩苷对AQP1表达及LTEP-A2细胞增殖、迁移、凋亡的影响观察
1.2.1 细胞培养及分组处理 LTEP-A2细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清、1.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL双抗（青霉素、链霉素）的DMEM培养基中，常规置于含5% CO2的37 ℃饱和湿度的恒温密闭培养箱内培养。定期观察细胞生长情况，每2～3 d换液1次，4～5 d后用0.25%胰酶消化传代。将处于对数生长期的LTEP-A2细胞分为对照组及黄芩苷组，对照组正常培养细胞；
黄芩苷组采用浓度200 μmol/L的黄芩苷处理LTEP-A2细胞48 h。
1.2.2 细胞AQP1表达检测 采用qRT-PCR法。采用Trizol试剂提取各组总RNA，PrimeScript™RT reagent Kit试剂盒进行反转录，SYBR Primescript RT-PcR试剂盒进行qRT-PCR，严格按照操作说明书操作。引物序列：AQP1正向引物5"-GTGCTATGCGTGCTGGCTAC-3"，反 向 引 物 5"-AAGGACCGAGCAGGGTTAATC-3"；
GAPDH正向引物 5"-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3"，反 向 引 物 5"-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3"。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算AQP1相对表达量。
1.2.3 细胞增殖情况观察 取各组LTEP-A2细胞，以1×104/孔接种于96孔板，置于5% CO2培养箱中在37 ℃下培养24 h。每孔中加入CCK-8溶液10 μL，继续培养2 h；
应用酶标仪检测各孔450 nm时的光密度值（OD），实验重复3次，并计算细胞增殖抑制率（IR）。IR =（对照孔OD-实验孔OD）/（对照孔OD-空白孔OD）×100%。
1.2.4 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。细胞铺板前，先用marker笔在6孔板的背面均匀画平行直线，0.5～1.0 cm一道，横穿过孔，每孔5条。取各组细胞，每孔加入2 mL含约5×105个细胞的培养基。待细胞铺满孔底后用枪头垂直于marker笔的横线划掉细胞。PBS轻轻漂洗掉划下的细胞，加入培养基，显微镜下拍照，记为0 h。拍照后将培养板放入37 ℃的CO2培养箱中继续培养24 h，取出拍照，计算细胞迁移距离。
1.2.5 细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。用不含EDTA的0.25%胰酶消化各组细胞，终止消化后离心，去上清，加PBS重悬；
再次用PBS将细胞润洗2次，1 200 r/min 离心5 min，严格按照AnnexinVAPC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明书操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。
1.3 过/降表达的AQP1对LTEP-A2细胞增殖、迁移、凋亡的影响观察 将处于对数生长期的LTEPA2细胞分为对照组、AQP1降表达组、AQP1过表达组，对照组不做处理正常培养，AQP1降表达组、AQP1过表达组分别转染AQP1小干扰siRNA及AQP1过表达载体48 h。按照“1.2.2”采用qRT-PCR法方法检测细胞AQP1表达，结果显示，对照组、AQP1降表达组、AQP1过表达组AQP1表达分别为1.00 ± 0.05、0.46 ± 0.15、1.31 ± 0.07，细胞AQP1表达AQP1过表达组＞对照组＞AQP1降表达组，提示转染成功。按照“1.2.3”的方法观察细胞增殖情况，按照“1.2.4”的方法观察细胞迁移能力，按照“1.2.5”的方法观察细胞凋亡情况。
1.4 黄芩苷下调AQP1的分子机制观察
1.4.1 细胞分组及处理 将转染AQP1过表达载体的AQP1过表达LTEP-A2细胞分为AQP1过表达组、AQP1过表达+黄芩苷组、AQP1过表达+LY294002组、AQP1过表达+wortmannin组，AQP1过表达组不做处理正常培养，另外各组分别采用浓度200 μmol/L的黄芩苷、40 μmol/L的 PI3Kα抑制剂LY294002、40 μmol/L的p-PI3Kα抑制剂wortmannin处理48 h。
1.4.2 黄芩苷调控AQP1对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响观察 采用Western blotting法。取处理后的各组细胞，移除细胞培养瓶中的细胞培养液，用预冷的PBS洗3遍，加入磷酸化蛋白酶抑制剂，将细胞样品移至1.5 mL离心管中离心5 min取上清，BCA法测定蛋白质浓度后保存于-20 ℃备用。水浴锅100 ℃变性，采用SDS-PAGE凝胶试剂盒配制10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后350 mA稳流转膜2 h，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，TBST洗涤5 min×3次；
置入塑料袋，加 1∶1 000浓度 VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α及GAPDH一抗，室温温育2 h，TBST洗涤10 min×3次后加1∶1 000相应二抗，室温温育1 h后TBST洗涤10 min×3次，ECL室温反应5 min，X线片曝光。X线片结果用Syngene凝胶成像仪扫描，以GAPDH作为内源性对照，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验分析正态性，符合正态分布的资料以±s表示，两组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 黄芩苷对LTEP-A2细胞AQP1表达的影响对照组、黄芩苷组AQP1分别为1.00 ± 0.05、0.75 ±0.07，黄芩苷组AQP1低于对照组（P＜0.05）。
2.2 黄芩苷对LTEP-A2细胞增殖、迁移、凋亡的影响 对照组、黄芩苷组IR分别为0.35% ± 0.14%、2.34% ± 0.37%，细胞迁移距离分别为（0.705 ±0.029）、（0.300 ± 0.022）μm，细胞凋亡率分别为4.02% ± 0.34%、20.66% ± 1.37%，黄芩苷组IR低于对照组，细胞迁移距离、细胞凋亡率高于对照组（P均＜0.05）。
2.3 过/降表达的AQP1对LTEP-A2细胞增殖、迁移、凋亡的影响 对照组、AQP1降表达组、AQP1过表达组IR分别为0.35% ± 0.14%、3.18% ± 0.21%、0.18% ± 0.04%，细胞迁移距离分别为（0.705 ±0.029）、（0.303 ± 0.049）、（0.859 ± 0.010）μm，细胞凋亡率分别为 4.02% ± 0.34%、21.94% ± 0.47%、3.12% ± 0.17%，IR AQP1过表达组＞对照组＞AQP1降表达组，细胞迁移距离、细胞凋亡率AQP1降表达组＞对照组＞AQP1过表达组（P均＜0.05）。
2.4 黄芩苷调控AQP1对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响 LTEP-A2细胞VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α 蛋白表达 AQP1过表达组＞AQP1过表达+黄芩苷组、AQP1过表达+LY294002组、AQP1过表达+wortmannin组（P均＜0.05），过表达+黄芩苷组、AQP1过表达+LY294002组、AQP1过表达+wortmannin组各项蛋白表达差异均无统计学意义。见表1。
表1 黄芩苷调控AQP1对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响（±s）
表1 黄芩苷调控AQP1对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响（±s）
注：与AQP1过表达组比较，*P＜0.05。
组别AQP1过表达组AQP1过表达+黄芩苷组AQP1过表达+LY294002组AQP1过表达+wortmannin组VEGF 0.906 ± 0.037 0.657 ± 0.025*0.623 ± 0.045*0.656 ± 0.034*IGF 0.711 ± 0.028 0.524 ± 0.078*0.546 ± 0.039*0.516 ± 0.029*mTOR 0.855 ± 0.017 0.759 ± 0.067*0.752 ± 0.048*0.760 ± 0.037*p-Akt 0.544 ± 0.039 0.392 ± 0.031*0.410 ± 0.051*0379 ± 0.021*HIF-1α 0.708 ± 0.046 0.480 ± 0.051*0.463 ± 0.028*0.469 ± 0.043*
肺腺癌在肺癌中占比较高，虽然该病理类型病情发展缓慢、恶性程度低，但因为存在微转移灶，使肿瘤细胞可通过血管和淋巴等途径向远处播散，多数患者发现时已是癌症中晚期。目前，化疗依然是肺腺癌治疗的主要手段，但不良反应及多药耐药的形成严重影响化疗效果和患者生存质量。因此，治疗肺腺癌需要更有效的药物及疗法。中医认为，肺癌是由邪毒内侵、肺络受损、痰瘀阻肺导致，宜减少失气、逆气、血瘀、输液、痰积、痰凝气滞、瘀血阻络。黄芩为唇形科植物，其干燥根味苦，性寒，归肺、胆、脾、大肠、小肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效。黄芩苷是黄芩的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌特性，对心血管、肝脏和肾脏有保护作用［6］。前期研究显示，黄芩苷在不同类型的恶性肿瘤中具有低细胞毒性和抗逆活性［7］。CHEN 等［8］研究发现，黄芩苷能够通过PDK1/Akt信号通路抑制上皮—间质转化，进而抑制NSCLC的进展。龙进［9］研究显示，黄芩苷对肺腺癌细胞A549具有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用。AQP是广泛分布于人体组织中的一类跨膜疏水性蛋白家族，在细胞代谢、增殖以及各种器官组织生理功能过程中发挥跨细胞膜快速水转运功能。AQP1是最早发现于红细胞膜上的水通道蛋白，位于质膜中，生理上主要存在于红细胞、肾脏、肺、血管内皮、脑以及动脉粥样硬化斑块的血管平滑肌细胞上。研究发现，AQP1表达异常与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌等恶性肿瘤的发生关系密切，在肿瘤相关水肿、肿瘤血管生成及内皮细胞迁移、肿瘤细胞外渗和转移等肿瘤生物学中可能发挥重要作用［10］。
本研究结果显示，使用黄芩苷处理LTEP-A2细胞后，LTEP-A2细胞AQP1表达降低，提示黄芩苷可下调AQP1表达。我们应用CCK-8法检验细胞的增殖率，发现黄芩苷可抑制LTEP-A2细胞增殖，同时AQP1过表达的LTEP-A2细胞增值能力高于AQP1降表达细胞，提示黄芩苷对LTEP-A2细胞增殖的这种抑制可能是通过下调AQP1表达实现的。细胞迁移是癌细胞转移与扩散的重要运动形式，本研究划痕实验表明，黄芩苷处理的LTEP-A2细胞迁移能力降低，同时AQP1过表达组细胞迁移能力明显加快，提示黄芩苷可通过下调AQP1表达抑制肺腺癌细胞迁移。肿瘤细胞可通过凋亡信号的失调，尤其是抗凋亡系统的激活来逃避凋亡或程序性细胞死亡，从而导致恶性增殖、治疗抗性和癌症复发［11］。因此，诱导细胞凋亡是许多抗癌药物的重要作用方式之一。本研究通过流式细胞术检测细胞凋亡率，发现黄芩苷可增加LTEP-A2细胞的细胞凋亡率，同时AQP1降表达亦能诱导细胞凋亡，提示黄芩苷可通过下调AQP1表达诱导肺腺癌细胞凋亡。
PI3K/Akt信号通路是体内细胞增殖、分化和凋亡的重要代谢途径。PI3K是参与细胞生长和增殖的基本酶，在包括肝癌在内的人类癌症中经常被过度激活。PI3K/Akt信号通路在正常情况下参与细胞增殖、凋亡、代谢及转录翻译等，但该通路异常活化后可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、侵袭转移和新血管生成。WANICZEK等［12］研究发现，PI3K/Akt信号通路异常活化后Akt可磷酸化mTOR、4EBP1等分子，向肿瘤细胞传达生存信号。闫康鹏等［13］发现，肝细胞生长因子可经PI3K/Akt信号通路促进VEGF表达，当PI3K/Akt通路异常活化后，VEGF高表达，最终诱导结直肠癌血管形成和转移。IGF通过激活IR-A/IGF-1R介导的PI3K/Akt信号通路促进肿瘤细胞的转移，在调节代谢，细胞功能，生长和分化中起重要作用［14］。肿瘤血管生长是由缺氧介导的HIF-1α上调引发的。HIF-1α可激活转录因子缺氧反应元件，诱导多种促血管生成因子的转录；
同时，HIF-1α还可诱导分泌细胞因子VEGF的产生，导致内皮细胞的生长［15］。由此，VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α等相关蛋白与PI3K/Akt之间的相互作用基本明确。为进一步详细阐明黄芩苷下调AQP1表达影响肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡的具体分子机制，我们采用Western blotting对PI3K/Akt信号通路中相关蛋白进行检测，结果显示AQP1过表达+黄芩苷组、AQP1过表达+LY294002（PI3Kα抑制剂）组、AQP1过表达+wortmannin（p-PI3Kα抑制剂）组VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α蛋白表达较AQP1过表达组明显降低，并且AQP1过表达+黄芩苷组、AQP1过表达+LY294002组、AQP1过表达+wortmannin组各通路相关蛋白表达水平无明显统计学差异，提示证明黄芩苷与其他两组PI3Kα抑制剂作用相同，均可降低p-PI3K与Akt相关蛋白水平，抑制PI3K/Akt信号通路激活。同时，上述结果也表明，黄芩苷可能通过PI3K-Akt信号通路抑制AQP1表达，从而降低肺腺癌细胞的增殖、迁移，诱导其凋亡。
综上所述，黄芩苷能够有效抑制肺腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制可能与抑制PI3K／Akt信号通路的激活并下调AQP1表达相关。黄芩苷作为一种潜在的抗癌药物，在未来可能会展现出更广泛的应用前景，本研究可为后来研究人员提供部分参考价值。
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